【文献速递】CAR-NK细胞疗法治疗血液系统恶性肿瘤

CAR-NK细胞可来源于多种细胞，包括脐带血（CB）、外周血（PB）、NK细胞系以及多能干细胞（PSC）。不同来源各具优势与局限，会影响最终CAR-NK细胞的表型特征及治疗效能。同样，细胞扩增和冻存工艺也是实现CAR-NK细胞规模化生产和临床应用的关键环节。此外，CAR-NK细胞的CAR结构设计及基因递送策略同样至关重要，包括胞内信号结构域、载体元件的优化，以及基因导入方式的选择，这些因素均会影响CAR-NK细胞的转导效率、安全性及治疗持久性。

外周血（PB） 是成熟NK细胞最易获取的来源，且分化周期较短。自体PB来源NK细胞几乎不存在免疫排斥风险，但由于自身主要组织相容性复合体（MHC）介导的抑制作用，以及既往治疗或基础健康状况可能导致NK细胞功能受损，其治疗效果可能受到限制。因此，临床上更倾向于采用异体PB来源NK细胞，可从健康供者分离并用于多名患者治疗，但也面临供者间生物学差异带来的挑战。由于外周血中NK细胞天然比例较低，PB来源NK细胞通常需要进行体外扩增。此外，其还存在基因转导效率较低以及长期激活后易发生功能耗竭等问题。目前，研究者正通过优化细胞因子组合、滋养细胞（feeder cells）及代谢补充策略，以提高PB来源NK细胞的扩增效率和功能。

脐带血（CB）来源NK细胞具有较强的增殖能力，可实现大规模扩增，使单份脐带血即可生产足够治疗多名患者的现货型CAR-NK细胞。目前的扩增技术已能够在临床规模下制备治疗级CB来源CAR-NK细胞，并表现出较强的抗肿瘤活性和较持久的体内存续能力。此前作者团队报道了全球首项人体Ⅰ/Ⅱ期临床研究，采用CB来源CD19 CAR-NK细胞治疗复发/难治性（R/R）血液系统恶性肿瘤，结果显示其具有显著的临床疗效和优异的安全性，进一步证明了CB是CAR-NK细胞治疗的重要来源。与异体PB类似，供者差异同样会影响CB来源NK细胞的质量。该临床研究的相关分析发现，有核红细胞数≤8×10且采集至冻存时间≤24小时的脐带血单位，是预测CAR-NK细胞功能和临床疗效更优的重要因素。这些发现进一步凸显了供者筛选在异体细胞治疗开发中的关键作用。

NK-92细胞系于1992年建立，来源于一名50岁非霍奇金淋巴瘤（NHL）患者的外周血。该细胞系易于扩增至临床所需数量，批间差异较小，并可方便地进行CAR基因工程改造。然而，为避免其在体内持续增殖及潜在致瘤风险，NK-92细胞在输注前必须接受辐照处理。临床研究表明，经辐照的NK-92细胞具有良好的安全性，并表现出一定的短期抗肿瘤活性；但由于其在患者体内存续时间有限，长期疗效可能受到影响，因此通常需要多次输注以维持治疗效果。

人胚胎干细胞（ESC）或诱导多能干细胞（iPSC）可稳定制备大批量、性质一致的CAR-NK细胞，具有几乎无限的扩增潜力，为现货型CAR-NK治疗提供了理想来源，同时也降低了供者间差异的影响。然而，该技术仍存在不足，包括NK细胞诱导分化过程复杂、耗时长、效率较低，且所得NK细胞常呈现相对未成熟表型，如杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）及CD16表达水平较低。此外，细胞重编程过程还可能引入具有潜在致瘤风险的遗传异常。尽管如此，随着诱导分化方案不断优化，干细胞来源CAR-NK细胞治疗展现出越来越大的应用潜力，并已逐步进入临床研究阶段。

由于体内NK细胞数量有限，而临床治疗需要大量细胞，因此体外扩增是NK细胞治疗应用的关键环节。目前常用的扩增策略包括细胞因子刺激、与滋养细胞（如表达膜结合型细胞因子的改造K562细胞）共培养，以及无滋养细胞的微粒（particle-based）扩增技术。这些方法均可促进NK细胞大量增殖，但通常需要数周时间才能获得满足临床治疗需求的细胞数量。此外，如何提高基因转导或基因编辑效率，同时维持NK细胞的增殖能力和活性，也是当前优化CAR-NK制备工艺的重要挑战。

K562细胞系来源于慢性髓性白血病急变期患者，是目前应用最广泛的NK细胞滋养细胞。由于K562细胞仍具有潜在致瘤性，因此在与NK细胞共培养前必须接受辐照处理；但若去除不彻底，最终制剂中仍可能残留K562细胞。因此，美国FDA对临床级NK细胞产品制定了严格的质量控制要求，以避免滋养细胞污染。为进一步提升安全性和满足监管要求，人工抗原递呈细胞（aAPC）及无滋养细胞扩增平台等新型技术正在积极开发中。

冻存是实现CAR-NK细胞规模化生产和现货型应用的重要基础。然而，与仍能较好保持杀伤活性的T细胞不同，NK细胞在复苏后往往出现存活率、回收率及功能明显下降，从而影响其后续扩增能力、体内存续及抗肿瘤活性。这种差异主要源于NK细胞自身的生物学特性：NK细胞富含预形成的细胞毒颗粒，因此颗粒度高于T细胞；同时，其表达多种先天免疫激活受体，可识别受损细胞表面的应激配体（如MICA/B及UL16结合蛋白）。冻存损伤可能导致颗粒酶B（GZMB）泄漏，或因应激配体诱导NK细胞相互杀伤（fratricide），从而增加细胞凋亡。因此，提高冻存复苏后的细胞质量，是推动CAR-NK现货治疗广泛应用亟待解决的问题。

CAR赋予免疫细胞以抗原特异性识别和杀伤肿瘤细胞的能力。典型CAR由胞外抗原识别结构域（通常为单链可变片段，scFv）、铰链区、跨膜区以及胞内信号转导和共刺激结构域组成。当CAR与靶抗原结合后，胞内信号结构域启动一系列信号转导过程，激活NK细胞发挥细胞毒作用。CAR各组成部分的来源会影响其稳定性、功能及体内持续性，例如铰链区和跨膜区常采用CD8α、CD28或免疫球蛋白来源，而胞内信号结构域则多采用CD3ζ、4-1BB或CD28。此外，用于递送CAR基因的载体骨架还包含启动子和poly(A)信号等元件，可调控CAR表达水平，并影响CAR蛋白的稳定表达。

为了更充分发挥NK细胞天然免疫优势，新一代CAR-NK设计逐渐引入NK细胞特异性信号分子，如DAP10、DAP12、2B4（CD244）及DNAM1等，与传统CD3ζ信号联合，以增强NK细胞天然共刺激信号并提高激活效率。目前研究显示，相较于DAP10、DAP12或4-1BB等胞内结构域，CD28联合CD3ζ在多种血液肿瘤及实体瘤模型中可进一步增强CAR-NK细胞的杀伤活性及持续性。不过，不同疾病背景下最优的共刺激结构域仍有待进一步探索。

CAR-NK细胞的构建可采用病毒或非病毒两大类基因递送方式。逆转录病毒能够高效整合至增殖中的NK细胞基因组，并已在Ⅰ/Ⅱ期临床研究中取得成功，患者无进展生存率达到68%，且安全性良好。其中，RD114假型逆转录病毒的转导效率优于γ-逆转录病毒及慢病毒。慢病毒既可感染增殖细胞，也可感染静止细胞，但其在NK细胞中的转导效率相对较低，因此限制了广泛应用。近年来，采用狒狒包膜（baboon envelope）假型化的慢病毒已显著提高NK细胞转导效率，并展现出良好的临床前抗肿瘤活性。

Sleeping Beauty（SB）转座子系统是一种非病毒基因递送技术，通过“剪切-粘贴”机制将CAR基因整合至NK细胞基因组。但由于其整合位点具有一定随机性，因此存在插入突变及潜在致瘤风险。事实上，采用piggyBac转座子构建的CAR-T细胞曾导致部分患者发生继发恶性肿瘤。近年来，研究者将微环DNA与SB转座系统结合，可使CAR基因更倾向整合至相对安全的基因组区域，同时保持较强的抗肿瘤活性，为CAR-NK构建提供了更安全的新策略。

另一种重要的非病毒递送方法是mRNA电穿孔。该技术利用电脉冲暂时增加NK细胞膜通透性，将编码CAR的mRNA导入细胞，而无需整合至宿主基因组。由于CAR表达具有暂时性，因此可降低长期毒性、插入突变风险、脱靶效应及监管难度。mRNA电穿孔尤其适用于早期临床研究，或用于验证新靶点CAR的安全性。

与CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞治疗，尤其是异体CAR-NK产品，具有多项显著优势，包括更优的安全性、更低的生产成本以及更易实现规模化制备。这些特点使CAR-NK细胞成为极具发展潜力的新一代细胞治疗策略。

目前，CAR-T细胞领域正积极探索开发异体“现货型”产品，通常通过敲除内源性T细胞受体（TCR）α链恒定区基因（TRAC）以降低移植物抗宿主病（GVHD）风险。然而，这一策略可能导致CAR-T细胞数量和质量下降，并因TCR信号缺失而削弱其固有功能。

相比之下，NK细胞天然不会引发GVHD，即使在HLA不匹配的情况下也可安全进行异体输注，而CAR-T细胞即使实现HLA匹配，仍存在GVHD风险。

因此，只要能够实现高质量冻存，CAR-NK细胞便可发展为一种快速、可规模化生产且成本较低的现货型细胞治疗产品。这不仅避免了针对每位患者单独制备CAR-T细胞所需的漫长生产周期（尤其对于经过多线治疗的患者而言更具挑战），还有助于降低治疗成本，并使病情快速进展的患者能够更早接受治疗。不过，如前所述，冻存仍会影响CAR-NK细胞的数量和功能，这也是现货型CAR-NK实现规模化应用亟待解决的重要问题。

CAR-T细胞治疗可引起严重不良反应，包括细胞因子释放综合征（CRS）和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS），常导致患者住院时间延长，并增加治疗成本。活化的免疫效应细胞大量释放促炎细胞因子，引发“细胞因子风暴”，可导致高热、低血压、低氧血症及多器官功能障碍。重度CRS（≥3级）发生率可高达30%，具体比例因CAR设计和疾病类型而异。ICANS则可发生于约50%的CAR-T治疗患者。此外，近期研究还报道了多发性骨髓瘤患者接受CAR-T治疗后出现帕金森综合征及运动障碍等非典型神经毒性，提示其可能与基底节脱靶效应或经典ICANS之外的神经炎症机制有关。

相比之下，现有早期临床研究显示，CAR-NK细胞治疗尚未观察到≥3级CRS或严重神经毒性，其不良反应主要表现为可控的血细胞减少、≤2级CRS及轻度输注相关反应。这种更优的安全性可能与CAR-NK细胞体内存续时间较短、细胞因子释放水平较低有关，也进一步凸显了CAR-NK细胞在安全性方面的优势。

NK细胞天然表达多种胚系编码的激活性受体，包括NKG2D、NKp46、NKp30、NKp44、NKG2C、DNAM-1及CD16等，可通过天然细胞毒作用和抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）识别并清除肿瘤细胞。CAR-NK细胞在此基础上进一步获得CAR介导的抗原特异性识别能力，使其兼具天然免疫杀伤与CAR定向杀伤两种机制，且无需预先致敏即可发挥作用，因此有望减少因肿瘤抗原异质性或抗原逃逸导致的治疗失败，提高抗肿瘤效果。

尽管CAR-NK细胞在血液系统恶性肿瘤治疗中展现出良好的应用前景，但其临床发展仍面临多项挑战，包括如何提高细胞扩增效率、延长体内存续时间以及增强抗耗竭能力等。

未经修饰的NK细胞天然寿命仅约2周，在缺乏内源性细胞因子持续支持的情况下，通常难以在体内长期存活或扩增。为延长CAR-NK细胞的持续性，研究者通过基因工程赋予其细胞因子“装甲（cytokine armoring）”功能，如表达IL-15或IL-21，可显著改善细胞体内存续及长期抗肿瘤活性，并已在临床研究中取得积极结果。然而，肿瘤微环境中的免疫抑制因子仍可加速NK细胞凋亡，而持续的肿瘤抗原刺激则可能导致NK细胞耗竭及活化诱导性细胞死亡（AICD），限制治疗效果。

肿瘤细胞大量消耗葡萄糖、氨基酸和脂质等营养物质，使NK细胞难以获得维持代谢、存活和细胞毒功能所需的能量来源。此外，肿瘤产生的前列腺素E₂（PGE₂）和乳酸等免疫抑制代谢产物，可干扰NK细胞关键信号通路，即使在远处转移灶中亦可发挥抑制作用。在结直肠癌转移灶组织中，乳酸可通过细胞内酸化及线粒体功能障碍诱导NK细胞凋亡。因此，改善CAR-NK细胞的代谢适应能力、增强其在肿瘤微环境中的存活和功能，是当前研究的重要方向。

肿瘤微环境中的调节性T细胞（Treg）、髓源性抑制细胞（MDSC）及M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAM）可分泌前列腺素E₂、转化生长因子β（TGF-β）及IL-10等免疫抑制因子，从多个层面抑制NK细胞功能。其中，TGF-β可抑制mTOR信号通路，降低NK细胞糖酵解及氧化磷酸化水平，导致其代谢功能障碍，这一现象已在转移性乳腺癌和急性髓系白血病（AML）中得到证实。TGF-β和IL-10还可下调CD16、NKG2D等关键活化受体的表达。作者团队进一步发现，在AML中，白血病细胞可通过TGF-β/SMAD/BATF信号轴，以细胞接触依赖方式诱导NK细胞耗竭，并形成稳定的表观遗传重塑。此外，MDSC可下调NKG2D及CD3ζ等关键激活分子，而Treg、M2型TAM及MDSC还可通过细胞接触抑制NK细胞脱颗粒及IFN-γ分泌。