【文献速递】靶向CD38的isatuximab及新型CD38/CD3×CD28 三特异性T细胞接合器在老年AML患者中的应用

急性髓系白血病（AML）是成人中最常见的急性白血病，其发病率在老年患者中显著增加。此外，虽然60岁以下成人的5年总体生存率（OS）约为40%，但60岁以上患者的生存率降至10%。AML的治疗模式正在从治愈性/高强度与姑息性/低强度的二分方法转向包括突变特异性靶向治疗、诱导凋亡的小分子药物和免疫疗法的新策略。然而，无法接受具有副作用的高强度化疗的老年患者以及复发/难治性疾病患者的生存率仍然很低。因此，发现新的治疗靶点和治疗方法是亟待解决的问题。

抗CD38单抗的使用显著延长了多发性骨髓瘤（MM）患者的OS。因此，达雷妥尤单抗和 isatuximab 被批准用于新诊断和复发/难治性疾病的治疗。在AML中，关于CD38作为治疗靶点的潜在作用的数据有限，特别是关于老年患者CD38水平的信息几乎没有。因此，本研究分析了不适合接受高强度化疗的AML患者中CD38的表达率和模式，并进行了临床前研究以探讨两种CD38靶向抗体（isatuximab和一种新型CD38/CD3×CD28三特异性T细胞衔接器（CD38-TCE））的抗肿瘤疗效。

在241例老年AML患者中，239例（99.2%）观察到CD38表达（图1A）。其中，134例（55.6%）表现为均质性CD38表达，105例（43.6%）表现为异质性CD38表达。相比染色体异常的患者，染色体正常的患者更多地表现为均质性CD38表达（66/97 [68%] vs 53/117 [45%]; P=0.001）；根据2010年医学研究委员会标准，与不良细胞遗传风险相比，具有良好/中间细胞遗传风险的患者中的均质性CD38表达更常见（98/156 [63%] vs 31/77 [40%]; P=0.001）。然而，诊断时CD38+肿瘤细胞的比例对总生存期（OS）没有影响（图1B）。在具有配对样本的患者中，从诊断到可测残留病灶评估（n=10）或直至复发（n=3），肿瘤细胞中CD38的密度未随时间降低（图1C-D；补充图1）。综上所述，这些结果表明CD38在老年AML患者中普遍存在，但其密度低于健康成人浆细胞（图1E）和多发性骨髓瘤（MM）患者中的观察结果。

由于本研究中研究的两种抗 CD38 抗体通过各自结合和激活自然杀伤（NK）细胞和 T 淋巴细胞来诱导肿瘤溶解，因此对 240 例老年 AML 患者的骨髓中这两种细胞类型的丰度进行了分析。基于半自动多色流式细胞术免疫表型分析（图1F），在大多数患者诊断时观察到了 BM NK 和 T 淋巴细胞的存在（图1G-H）。因此，老年 AML 患者在肿瘤扩增的主要部位显示出免疫效应细胞，加上上述肿瘤细胞中的 CD38 表达，支持了 isatuximab 和 CD38-TCE 的临床前研究。

研究人员选择了两种 AML 细胞系（MOLM-13 和 OCI-AML3），它们的 CD38 密度与 AML 患者相当，以及一种 CD38 水平显著较低的细胞系（KG-1）用于临床前研究。将 AML 细胞系和健康成人分离的 NK 淋巴细胞或单核细胞衍生的巨噬细胞（n=3）与 isatuximab (70 nM) 共同处理，分别增强了抗体依赖性细胞毒性和吞噬作用，尤其是在显示最高 CD38 密度的两个细胞系中（图2A-B）。此外，来自 AML 患者的 BM 抽吸液中观察到显著的肿瘤溶解（n=17; P=0.0002），特别是在 CD38 均质表达的患者中（中位数为 19.5%; P=0.004）相比异质性表达的患者（中位数为 4%; P=0.125）（图2C）。这些结果表明，与多发性骨髓瘤（MM）相似，isatuximab 在 AML 中的作用机制可能受到 CD38 水平的影响（图2D），且具有异质性 CD38 表达的患者对抗 CD38 单克隆抗体的反应可能较差。

表达减少的 CD38 的白血病细胞可能通过其他对目标抗原密度依赖性较小的免疫治疗方式（如抗 CD38 嵌合抗原受体 T 细胞和 T 细胞接合器）裂解。因此，进一步进行了包含抗 CD28 共刺激信号的 CD38-TCE 的临床前研究，以在较低药物浓度下增强 T 细胞激活和增加肿瘤溶解。确实，使用 CD38-TCE 处理 MOLM-13 和健康成人 PBMC（n=6），随着 CD38-TCE 浓度的增加，CD69+ T 淋巴细胞显著扩增，相比之下，isatuximab 无显著作用（图2E）。有趣的是，相较于 isatuximab，CD38-TCE 的处理还激活了更高程度的 NK 淋巴细胞。进一步的实验显示，CD38-TCE 诱导的 NK 淋巴细胞激活可能是 T 细胞依赖的旁观者效应。

CD38-TCE 同时激活两种效应细胞类型，与仅激活 NK 细胞的 isatuximab 相比，可能导致更强的肿瘤耗竭。相应地，将 isatuximab 或 CD38-TCE（均为 700 pM）处理 PBMC（n=6）和 MOLM-13 细胞（效应细胞与靶细胞比为 10:1）48 小时，结果显示后者的肿瘤耗竭显著更高（图2F）。在一些 AML 患者（n=8）的 BM 抽吸液中观察到 CD38-TCE 介导的肿瘤耗竭，包括 2 例对 isatuximab 耐药但对 CD38-TCE 敏感的白血病细胞（图2G）。相反，1 例患者的肿瘤细胞对 isatuximab 敏感，但对 CD38-TCE 不敏感。值得注意的是，CD38-TCE 的疗效与肿瘤细胞中的 CD38 表达无显著相关性，并且抗原在结合后未从细胞表面脱落。

在临床前试验中，治疗 AML 患者的 BM 抽吸液后，免疫细胞类型的比例保持不变，这表明 CD38-TCE 不会引起显著的靶向非肿瘤毒性。与预期一致，在 AML 患者的 BM 抽吸液中未检测到正常的 CD34+ 祖细胞，因此无法分析靶向非肿瘤毒性。在健康成人中，CD34+ 祖细胞显示出高于免疫细胞的 CD38 密度，且未观察到明显的靶向非肿瘤毒性。

综上所述，研究结果表明 CD38 可能在 AML 中作为治疗靶点发挥潜在作用。然而，由于并非所有患者均匀表达 CD38，且抗原密度低于其他血液恶性肿瘤（如 MM），因此免疫治疗方式需要根据肿瘤细胞中 CD38 表达的模式和水平进行调整。此外，CD34+ 祖细胞中高密度的 CD38 可能暗示治疗时间需要调整，以减轻 CD38-TCE 尤其可能引发的血液学不良事件的风险。未来进一步的体内研究将有助于验证这一假设。

图 1. 老年 AML 患者中的 CD38 表达和肿瘤免疫组成

(A) 241 名新诊断 AML 老年患者按 CD38 表达模式的分布：阴性、异质性和均质性阳性。

(B) PETHEMA/FLUGAZA 3 期临床试验中治疗的 241 名老年 AML 患者的 OS，根据诊断时 CD38+ 肿瘤细胞的百分比分层：<50%（绿色）、50% 至 99%（蓝色）和 100%（红色）。

(C-D) 配对患者在诊断时、3 次诱导周期后达到完全缓解且有可测残留病灶（MRD，n = 10）的患者，以及复发时（n = 3）的 CD38 表达。

(E) 241 名 AML 患者的肿瘤细胞和 10 名健康成人的骨髓浆细胞中 CD38 的平均荧光强度（MFI）。

(F) 使用t-SNE投射老年 AML 患者和健康成人（n = 10）骨髓中的有核细胞。

(G-H) AML 患者与健康成人的骨髓中 NK 细胞和 T 淋巴细胞在总存活有核细胞中的频率比较。

图 2. 以 isatuximab 和 CD38/CD3 × CD28 三特异性 T 细胞接合器（CD38-TCE）靶向 CD38 的研究。选择 KG-1、MOLM-13 和 OCI-AML3 AML 细胞系是因为它们分别具有低和高密度的 CD38 表达

(A) 进行三次重复的抗体依赖性细胞毒性（ADCC）实验，采用 isatuximab (70 nM) 处理 AML 细胞 24 小时，并与健康成人的 NK 淋巴细胞共培养（效应细胞与靶细胞比 [E:T] = 1:1）。ADCC 通过 Annexin-V+ 肿瘤细胞的百分比测量。

(B) 在健康成人衍生的单核细胞来源巨噬细胞与 AML 细胞（Φ:AML = 1:2）共培养 30 分钟后，使用 VPD 染色并以 isatuximab (70 nM) 进行预处理，进行抗体依赖性细胞吞噬（ADCP）实验三次重复。ADCP 通过 2 小时共培养后 CD14/CD300e/VPD 三阳性巨噬细胞的百分比测量。

(C) 在老年 AML 患者（n = 17）的 BM 抽吸液中，isatuximab (70 nM) 处理 24 小时后的肿瘤细胞耗竭。结果表示为处理与未处理样本相比的相对增量。

(D) 使用 Infinicyt 软件将来自老年 AML 患者（n = 241）的白血病细胞样本的数据与 KG-1、MOLM-13 和 OCI-AML3 细胞系的数据合并。CD38 的平均荧光强度（MFI）通过群体带状直方图表示，并按照 AML 细胞系中从最低到最高的表达顺序排列。ADCC 和 ADCP 诱导所需的 CD38 MFI 以虚线表示，用于概述 A-B图中描述的结果。

(E) 使用 VPD 标记 MOLM-13 细胞，分别用 isatuximab 和 CD38-TCE 及其相应同型对照进行 30 分钟预处理，然后与健康成人 PBMC（n = 6）以 10:1 E:T 比共培养 48 小时。效应细胞的激活通过 CD69+ T 和 NK 淋巴细胞的百分比测量。对于统计学显著性，最高剂量与同型对照处理条件进行比较：绿色和蓝色符号分别表示 T 和 NK 细胞；* 和 # 分别表示 isatuximab 和 CD38-TCE 处理。

(F) isatuximab 和 CD38-TCE 预处理后，在与健康成人 PBMC 共培养 24 和 48 小时后，通过 Annexin V 染色测定 MOLM-13 肿瘤细胞的死亡率。

(G) 在 AML 患者（n = 8）的原代样本中，isatuximab (700 pM) 和 CD38-TCE (700 pM) 处理 48 小时后的肿瘤细胞死亡率。肿瘤细胞死亡率的计算方法为：[(未处理样本中白血病细胞百分比 - 处理样本中白血病细胞百分比) / 未处理样本中的白血病细胞百分比] × 100。每条彩色线表示一个患者样本，紫色和灰色线代表对 isatuximab 耐药而对 CD38-TCE 敏感的两例患者。

(H) 在 CD38-TCE (700 pM) 处理 48 小时后，BM 中 CD45+ 有核细胞中的中性粒细胞、单核细胞、NK 细胞、B 细胞以及 CD4 和 CD8 T 淋巴细胞的百分比相对于同型对照的处理结果进行标准化，设置为 100%。

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