预测ICIs治疗微卫星稳定癌症获益和预后的肿瘤突变负荷阈值和组织学类型的相关性

免疫检查点抑制剂（ICIs）只是对部分癌症类型和患者有效。因此需要预测性生物标志物来识别可能获益人群，并更好了解耐药机制。对ICI的耐药和多种宿主和肿瘤内在因素相关，这些因素中的核心在于肿瘤内功能性抗原特异性T细胞的发育。因此，有效的癌症免疫疗法的基本要求是免疫细胞识别肿瘤新抗原，从源头驱动或放大现有的T细胞反应。在接受ICI治疗的患者中进行的早期临床观察发现，由于错配修复缺陷而导致微卫星不稳定性(MSI)的癌症与肿瘤对ICI的高疗效相关。这是由于此类肿瘤中存在高肿瘤突变负荷(TMB)，从而导致更高的新抗原负荷，从而实现ICI治疗后的免疫细胞激活和肿瘤抑制。独立于MSI的TMB被认为与黑色素瘤和非小细胞肺癌(NSCLC)的ICI获益相关，这一结论因样本量小受到质疑。

在非随机、开放标签KEYNOTE-158临床研究的基础上，抗程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）抗体帕博利珠单抗获得FDA批准用于治疗具有高TMB（TMB-H定义为每Mb≥10个突变）的难治性癌症，该研究显示TMB-H和TMB-L的微卫星稳定患者的客观缓解率分别为27.1%和6.7%。然而，由于中位无进展生存期和总生存期(OS)无差异，因此TMB≥10个突变/Mb与长期生存的相关性受到质疑。此外，KEYNOTE-158的队列由来自少数癌症类型的少数患者组成（105名患者涉及10种癌症）。之前的泛癌分析表明，TMB与许多癌症类型中ICI治疗后更高的肿瘤反应和生存率相关，然而先前的研究受到个体癌症类型样本量较小的限制，无法确定不同组织类型肿瘤从ICI治疗获益的TMB國值是否一致；患者纳入范围有限，可能无法反映一般人群的情况；少见疾病患者入组少；无法区分疗效获益和预后获益。后一个问题至关重要，因为TMB-H癌症的生存可能是由独立于治疗的生物学驱动的，这可能混淆了TMB作为预测标志还是预后指标的作用。因此，要使TMB的临床效用得到充分认识并融入精准肿瘤学中，若干关键问题仍有待解决：(1)TMB是ICI治疗后OS的通用预测指标而非预后生物标志物吗？(2)TMB阀值作为标志物是否具有组织特异性？(3)TMB与生存获益之间的关系是否和定量高低有关？(4)经常用作于ICI敏感性衡量的免疫相关因素是否与TMB的预测价值一致？本研究分析了一个大型的全国性真实临床基因组数据集（CARIS队列）来解决这些问题。

CARIS队列包括美国70,698名晚期癌症患者，这些患者分布在27种不同组织学类型，由CLIA认证的实验室进行了基于组织的基因组分析。纳入复发性、难治性、转移性III期或IV期癌症，随后接受全身治疗。该队列包括所有TMB患者和临床转归数据，除外微卫星不稳定患者。ICI和非ICI治疗方案取决于主管医生。

CARIS队列使用IIIumina的Next-Seq或NovaSeq 6000平台对从福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤样本中分离的基因组DNA进行二代测序。所有变异的检测置信度超过99%，平均测序覆盖深度超过500，分析灵敏度为5%。通过对7,000个目标微卫星位点进行二代测序并与参考基因组hg19进行比较来确定微卫星状态。TMB为每Mb识别的非同义体细胞突变数。

如果患者接受了帕博利珠单抗、纳武利尤单抗、阿替利珠单抗、度伐利尤单抗、Avelumab或Cemiplimab治疗或者其他PD-1/PD-L1单抗免疫化疗，则将分入ICI组（n=14,736），否则为非ICI组（n=55,962），但接受CTLA-4治疗的患者被排除在两个队列之外。TMB阈值反复调整，最高为TMB的第90个百分位数，据此将患者分类为TMB-H或TMB-L。然后使用Cox回归分析来评估。在ICI队列中，OS是从首次给予第一种抗PD-1/L1疗法的时间开始计算的。在非ICI队列中，OS是从首次使用第一种非ICI全身药物的时间开始计算的。在27种组织学类型中，12种癌症类型至少有一个TMB阈值与ICI治疗的生存获益相关（黑色素瘤、NSCLC、小细胞肺癌、膀胱癌、宫颈癌、结直肠癌、胃癌、卵巢癌、头颅癌、颈部癌、外阴癌、原发灶不明的癌和肉瘤CUP）。在两种癌症类型（胆管癌和神经内分泌肿瘤）中，TMB阈值与ICI治疗后OS较差相关。

在非ICI队列中，七种癌症（膀胱癌、子宫内膜癌、头颈癌、CUP、食道癌、卵巢癌和神经胶质瘤）至少有一个TMB阈值与生存率改善相关，八种癌症（非小细胞肺癌、宫颈癌）癌症、结直肠癌、神经内分泌肿瘤、前列腺癌、间皮瘤、肉瘤和甲状腺癌）至少有一项TMB阈值与生存率较差相关。在NSCLC中，随着TMB增加至每Mb10个突变，生存受损，这与先前的研究一致，表明较高的TMB与接受EGFR抑制剂治疗的EGFR突变NSCLC患者的生存较差相关。对于子宫内膜癌和神经胶质瘤，仅在非ICI队列中观察到TMB与OS之间呈正相关。这些发现表明，TMB与一部分癌症类型的生存获益或损害相关，具体取决于治疗方案。在四种癌症类型（膀胱癌、头颈癌、卵巢癌和CUP）中观察到ICI和非ICI队列之间相似的生存获益，这表明TMB在这些癌症中可能具有预后作用，而不是疗效预测作用。

ICI治疗的生存获益的TMB阈值范围从黑色素瘤中每Mb2个突变到结直肠癌中每Mb9个突变。按TMB百分位计算，四种癌症类型需要TMB阈值高于第60个百分位（结直肠癌、外阴癌、头颈癌和肉瘤）才能预测ICI治疗的OS获益，而八种癌症需要TMB阈值在第13个百分位和第47个百分位之间。研究证明使用与癌症组织类型无关的绝对TMB阈值来确定ICI治疗获益的是不合适的。

具有最大预测价值的TMB阈值（定义为最低生存风险比HR）多接近特定癌症类型的最高TMB，这表明ICI获益可能随着TMB定量升高而扩大。事实上，TMB阈值和HR之间的相关性经常为负，表明较高的TMB阈值与较低的死亡HR相关，但有两个例外。黑色素瘤具有显著正相关性，而SCLC则不存在显著相关性。TMB定量和ICI治疗获益之间缺乏相关性可以用饱和效应来解释，即新抗原数量的增加不会增强抗肿瘤免疫力。或者，突变特征、人类白细胞抗原(HLA)基因型的表达或新抗原质量的差异可能对黑色素瘤和SCLC的ICI疗效产生不同的影响。在非ICI队列中，在TMB与生存获益相关的多种癌症类型中观察到负相关，包括膀胱癌、子宫内膜癌、头颈癌、食道癌以及CUP。在任何治疗后TMB与OS获益受损相关的癌症中，在用ICI治疗的胆管癌以及非ICI治疗的宫颈癌、前列腺癌、甲状腺癌、间皮瘤中观察到正相关。这些发现表明TMB定量与临床转归的关系取决于组织类型和环境。无论ICI是用于一线还是后续治疗，TMB定量对临床转归的效应相似。

肿瘤微环境(TME)的特征常被用作所有类型癌症ICI治疗敏感性的指标。例如，PD-L1免疫组织化学表达可指导ICI的使用，而CD8+T细胞浸润和炎症基因特征通常与高TMB相关，并被认为是预测ICI疗效的泛癌症替代指标。在27种癌症类型中，TMB-H癌症（使用第四个四分位数作为截止值）与12种(44.4%)癌症PD-L1表达的肿瘤细胞频率增加、7种癌症(25.9%)T细胞炎症评分升高以及12种癌症(44.4%)中CD8+T细胞浸润增多相关。由于只有一部分癌症TMB和TME特征之间存在关联，因此研究者评估了在高TMB与ICI治疗获益相关患者中，免疫是否与癌症类型相关。12种TMB-H与ICI治疗获益相关癌症类型中，肿瘤细胞PD-L1表达与8种癌症类型相关；15种TMB-H与ICI治疗后获益无关癌症类型中，肿瘤细胞PD-L1表达与4种癌症类型相关。与之对应，T细胞炎症评分分别为4种和3种。CD8+T细胞浸润分别为8种和4种。虽然研究的癌症类型数量限制了统计功效，但TMB-H癌症中CD8+T细胞显著富集（Fisher精确检验，P=0.02），但PD-L1表达或T细胞炎症评分没有显著变化。这些结果表明，免疫生物标志物并不总是与TMB-H癌症相关，并且与许多癌症类型的ICI获益具有不同的关联。

本研究为了解TMB在许多常见和罕见恶性肿瘤中的ICI疗效预测和预后判断作用提供了帮助，对完善TMB作为临床生物标志物的认识具有重要意义。