液体活检在抗肿瘤免疫分析中的应用与展望

组织活检仍是癌症诊断及生物标志物指导治疗患者筛选的金标准。肿瘤组织的空间分析能够揭示局部抗肿瘤免疫反应，但反复取材具有侵入性，通常无法用于持续监测随时间变化的免疫状态。外周血易于重复采集，技术进步已使血液中细胞及其产物的多模态分析成为可能。液体活检虽然不能提供肿瘤免疫微环境的空间信息，且肿瘤来源物质在循环中可能被大量稀释，但能够监测全身免疫动态、预判免疫治疗反应并发现逐渐出现的耐药，因此可作为组织分析的重要补充。

液体活检最初是指循环肿瘤细胞的检测与分子表征，随后扩展至循环肿瘤DNA、肿瘤来源细胞外囊泡、循环免疫细胞、肿瘤教育血小板（tumour-educated platelets，TEPs，是指在肿瘤存在的情况下，被肿瘤及其相关炎症环境“重新编程”的血小板）及可溶性免疫介质。血液检测原则上能够在不同时间点同时捕捉患者全部肿瘤病灶释放的信号，但目标分析物淹没在大量非肿瘤细胞和非肿瘤来源分子中，因此组织与血液分析均有局限，二者结合可能更全面地反映抗肿瘤免疫。

循环肿瘤DNA是循环游离DNA中来源于肿瘤的部分，主要由凋亡癌细胞DNA裂解释放形成，可根据突变、片段长度、甲基化模式等肿瘤特异性特征检测。肿瘤知情型检测（tumour-informed assay指先分析患者本人的肿瘤组织，找出这个肿瘤特有的分子改变，再据此定制血液中的ctDNA检测方案），先对肿瘤组织测序，再建立患者个体化检测靶点，敏感性通常高于使用预设癌症相关基因或表观遗传特征的肿瘤不知情型方法，但依赖足量且质量合格的组织。免疫检查点抑制剂治疗期间，ctDNA的早期下降通常与治疗反应相关，并可能早于影像学变化，有助于区分真正进展与假性进展。

ctDNA水平可用于估计“分子肿瘤负荷”，并在治疗后判断分子残留病。可切除非小细胞肺癌研究显示，术后仍可检出ctDNA的患者无病生存明显较差；治疗中ctDNA清除或术前转阴与更高的病理缓解率和更长的无事件生存相关，而术后持续存在或重新出现则提示复发风险。尽管ctDNA阳性能够识别极高危患者，阴性并不能排除残留病灶，因为残余肿瘤负荷或DNA释放量可能低于检测限。即使在转移性疾病中，部分患者基线也无可检出的ctDNA。因此，仅依据ctDNA阴性进行治疗降阶目前仍属于试验性策略。

ctDNA水平不仅受肿瘤体积影响，还与肿瘤增殖、细胞凋亡、血管化和转移部位有关。化疗开始后可能出现短暂升高，反映大量癌细胞死亡。感染、自身免疫性疾病或免疫相关不良事件可增加非肿瘤来源cfDNA，使ctDNA相对比例下降并干扰肿瘤负荷判断。脱水、血容量变化、输血和剧烈运动也可改变检测值。血液肿瘤突变负荷可间接反映肿瘤抗原性，但其与组织TMB仅部分相关，检测平台、算法及阈值尚未标准化，前瞻性随机研究也未一致证实其预测价值。

cfDNA片段组学通过分析片段长度、末端基序和核小体足迹，能够提供突变检测以外的信息，包括肿瘤存在、肿瘤比例、组织来源、染色质开放程度及转录活动。部分研究发现，抗PD-1治疗一个周期后出现的甲基化和片段特征变化可预测生存，短片段比例增加可能反映细胞毒性T细胞或自然杀伤细胞诱导的肿瘤凋亡。然而，炎症和自身免疫疾病同样可改变片段及甲基化特征，因此需要联合多种标志物解释。

循环肿瘤细胞从原发灶或转移灶进入血液，其数量在乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌中具有预后价值，但通常每十亿个血细胞中不足一个，检测极具挑战。单细胞测序和高维细胞术能够分析其免疫检查点、抗原呈递及天然免疫调节表型。CTC可通过遮蔽MHCⅠ、获得CD45样“免疫伪装”、表达PD-L1、CD47、AXL和HLA-E，以及与中性粒细胞或血小板形成簇而逃避免疫监视。PD-L1阳性CTC在多种肿瘤中均可检测到，但其与组织PD-L1并不一致，各研究对免疫治疗反应的预测结果也不统一。相比单一时间点，治疗过程中CTC数量及表型的动态变化可能更有价值。

血小板能够包裹CTC，转移MHCⅠ分子形成“假正常”表型，并通过TGFβ、PDGF、CXCL4及CD155–TIGIT等通路促进上皮—间质转化、抑制自然杀伤细胞并推动转移。肿瘤教育血小板可摄取肿瘤RNA和蛋白，形成癌症相关转录组特征，可能用于诊断、确定组织来源和识别分子异常。血小板PD-L1也可能与免疫治疗反应相关，但血小板高度可塑，容易受到炎症、细胞因子和采样处理影响。

细胞外囊泡既可来源于肿瘤细胞，也可来源于免疫及基质细胞，能够远距离运输蛋白、脂质和RNA。部分免疫细胞来源囊泡可促进抗原呈递、T细胞活化和肿瘤细胞死亡；肿瘤来源囊泡则可诱导髓系细胞向免疫抑制表型转化、扩增调节性T细胞、抑制自然杀伤细胞并促进CD8⁺T细胞耗竭。携带PD-L1、FasL等配体的囊泡可能抑制淋巴细胞或结合循环中的治疗性抗体。较高的PD-L1阳性囊泡水平在部分研究中与免疫治疗不良反应相关，但其来源并非肿瘤特异，也可能反映炎症或正在发生的免疫反应。

循环免疫细胞表型、T细胞受体克隆性及血浆蛋白可进一步反映系统性免疫状态。应答者常出现效应或记忆T细胞克隆扩增、细胞毒性基因和干扰素信号增强、抗原呈递功能改善；非应答者则更常见慢性炎症、髓系抑制、T细胞耗竭及IL-6、IL-8、VEGF等升高。外周血免疫特征不能直接替代空间组织微环境，且受肿瘤类型、疾病阶段、治疗、合并症和炎症状态影响。

液体活检的临床应用仍需要独立多中心前瞻性验证、采血时间和检测阈值统一、平台与生物信息流程标准化，并通过干预性试验证明其能够改善临床决策。多组学和人工智能可能整合ctDNA、CTC、细胞外囊泡、免疫细胞、血小板及血浆蛋白，但模型必须透明、可解释、可重复，并能在临床决策时限内提供结果。成本、设备、实验室能力及可及性同样可能造成实施差异。总体而言，血液标志物为观察肿瘤与免疫系统的动态相互作用提供了非侵入、实时窗口，其最成熟的用途是监测治疗反应和分子残留残留病灶（MRD）；用于指导免疫治疗升级、降阶或更换方案，仍需进一步临床验证。