中国发表 | 血液p-tau217一升一降：阿尔茨海默病的囊泡分泌障碍与HSPA8

● 血浆游离p-tau217是当前阿尔茨海默病（AD）血液标志物研究中的重要指标，但另一项观察长期缺乏解释：AD患者血浆中携带p-tau217的细胞外囊泡（EV）比例反而下降。游离型升高、囊泡型降低，两者方向相反。近日，浙江大学医学院附属第一医院章京教授及彭国平教授研究团队在Translational Neurodegeneration发表研究，将这一现象归因于神经元囊泡合成与分泌受损：AD中异常升高的热休克蛋白家族A成员8（HSPA8）促进β-淀粉样蛋白（Aβ）与SNAP29结合，阻碍SNARE复合体组装；降低HSPA8水平或以小分子肽阻断该相互作用，均可恢复模型小鼠p-tau217⁺ EV的分泌并改善认知功能。

● 研究团队此前依托包含21例AD患者与22名健康对照（脑脊液）、30对血浆样本的队列，复测游离p-tau217，确认其在AD脑脊液和血浆中均升高，与囊泡型p-tau217方向相反。对这一组合，作者提出三种候选解释：囊泡从中枢向外周的转运受损；囊泡降解增加；囊泡合成或分泌障碍。

● 转运假说最先被排除。作者以星形胶质细胞、脑微血管内皮细胞和周细胞构建体外血脑屏障（BBB）模型，跨内皮电阻从基线约21 Ω·cm²升至第5天的405 Ω·cm²，屏障功能完好。将等量p-tau217标记的血浆囊泡分别加入完整模型与Aβ42处理模型，后者跨屏障的囊泡比例反而更高，说明AD外周血囊泡型p-tau217减少并非转运能力下降所致。

● 降解假说同样不足以解释现象。5 μM Aβ42处理SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞后，细胞内p-tau217荧光强度升高、溶酶体活性下降，提示降解能力受损；但CD9标记的囊泡信号下降更明显，合成与分泌环节受累更重。细胞活力与乳酸脱氢酶（LDH）释放均无显著变化，排除了细胞死亡导致囊泡减少的可能；突触素荧光强度下降、轴突长度缩短，提示Aβ42处理同时造成突触损伤。

● 这一改变不限于217位点。p-tau181⁺与p-tau396⁺ EV在Aβ42处理细胞中同样减少，p-tau231⁺ EV无显著变化；总tau在细胞内和囊泡中均无改变，说明Aβ42损伤的是磷酸化tau种类的选择性包装与分泌，而非tau的总体生成。在APP/PS1小鼠中，血浆p-tau217⁺ EV比例3月龄时两组无差异，12月龄时显著下降，同期游离p-tau217显著升高，随年龄依赖的病理进程再现了患者中的反向变化。

● 为寻找分泌障碍的责任分子，作者从AD与健康对照脑脊液中免疫捕获p-tau217⁺ EV进行质谱分析（每组3份混合样本，每份由5人等量脑脊液混合），AD组44个蛋白显著上调、81个显著下调；差异蛋白富集于细胞外囊泡、血液微粒与分泌颗粒腔等组分，蛋白质相互作用网络将范围缩小至15个枢纽基因。

● 区分上游调控者与下游效应物依赖tau磷酸化状态的模拟：作者以T217D（磷酸化模拟）与T217A（去磷酸化模拟）突变体转染细胞，SERPINC1、NCAM1、GC、CLU、NRXN1等基因的mRNA水平随苏氨酸217磷酸化状态改变，可能是囊泡内容物的下游效应分子；HSPA8等12个基因无变化，更可能为上游调控者。其中HSPA8已有参与SNARE复合体功能调控的报道，而SNARE复合体正是控制多泡体（MVB）形成与囊泡合成的核心机器。

● 多条证据显示HSPA8在AD中异常升高：Aβ42处理细胞中其蛋白水平上升；人海马空间转录组数据（每组8例）中AD海马HSPA8表达升高；tau T217磷酸化状态不影响HSPA8蛋白水平，进一步排除其作为p-tau217下游分子的可能。shRNA敲低HSPA8后，Aβ42处理细胞的p-tau217⁺ EV分泌比例显著回升，确立其负向调控作用。

● AD模型中SNARE相关分子SNAP23、SNAP25、SNAP29、VAMP7、VAMP8、STX4、STX16的mRNA普遍上调，敲低HSPA8后部分回落，蛋白水平呈同步变化。免疫共沉淀显示，HSPA8与p-tau217、SNAP23、SNAP29的相互作用在Aβ42处理状态下减弱，敲低HSPA8后增强；HSPA8与SNAP25、VAMP7、VAMP8、STX4、STX16之间未检出相互作用。

● 共定位分析将关键节点定位到SNAP29。Aβ42处理细胞中，Aβ–SNAP29与Aβ–SNAP23共定位增加、HSPA8–SNAP29共定位减少，敲低HSPA8可逆转上述变化。5×FAD小鼠皮层及海马CA1、CA3区Aβ–SNAP29共定位显著增加，相应区域Aβ斑块负荷升高；HSPA8–SNAP29共定位在皮层显著下降。SNAP23轴在小鼠脑内无显著组间差异，提示HSPA8的影响主要经由SNAP29实现。

● 综合上述结果，机制链条为：AD中HSPA8异常升高，促进Aβ与SNAP29结合，SNAP29被占用后功能性SNARE复合体组装受阻，MVB介导的囊泡合成与分泌受损；p-tau217滞留于神经元内，外周血囊泡型p-tau217随之减少。作者还证实p-tau217同时存在于囊泡膜表面与囊泡腔内，透膜处理后检测信号显著增强。

● 基因层面，作者向6月龄APP/PS1小鼠海马立体定位注射HSPA8 shRNA，1个月后评估（每组10只）：新物体识别无组间差异，Y迷宫自发交替率改善，Morris水迷宫第5天逃避潜伏期缩短、目标平台停留时间增加；血浆p-tau217⁺ EV比例回升，海马Aβ–SNAP29共定位减少、HSPA8–SNAP29共定位增加（每组5只）。

● 分子层面，AlphaFold Server结构预测将HSPA8–SNAP29结合区域定位于SNAP29第166–170位残基，作者据此合成覆盖第156–180位残基的25肽，竞争性阻断该位点。体外实验中，25肽与HSPA8直接结合并被神经元内化，减少Aβ42处理细胞的Aβ–SNAP29共定位、增加HSPA8–SNAP29共定位，培养上清p-tau217⁺ EV比例显著升高（每组12次检测）。8月龄APP/PS1小鼠海马注射25肽7天后，新物体识别与Y迷宫自发交替改善，旷场中心停留时间呈下降趋势，水迷宫穿越平台次数与目标象限时间呈增加趋势；血浆p-tau217⁺ EV比例显著升高（每组8只）。肽治疗未改变Aβ斑块负荷与总tau水平，但海马CA1神经元p-tau217/总tau比值显著下降，提示干预效应集中于tau磷酸化与囊泡分泌环节。

● 对解读血液标志物而言，本研究的直接启示在于，血浆游离与囊泡型p-tau217承载不同的生物学信息：游离型升高反映tau磷酸化病理的总体强度，囊泡型降低则更多指向神经元囊泡分泌功能的障碍，二者并不矛盾，而是同一病理过程的不同侧面。若未来将囊泡型p-tau217用作疗效或进展指标，需将疾病状态本身对囊泡分泌能力的影响纳入考量。此前甲唑酰胺促进tau外排可改善小鼠认知的报道，与本研究结果方向一致——恢复磷酸化tau的分泌能力，本身可能是降低神经元内tau负荷的途径。

● 治疗层面，HSPA8及其调控的SNAP29–Aβ相互作用提供了区别于清除Aβ斑块或直接降低tau的干预入口。两种干预手段均未改变斑块负荷即改善小鼠认知行为，提示靶向囊泡分泌机器可在不触动经典病理的情况下产生获益；25肽给药7天内出现行为学效应，验证周期短于shRNA方案。

● 作者同时指出研究遗留的问题：HSPA8促进SNAP29–Aβ结合的确切机制尚未阐明；体内部分使用APP/PS1小鼠而非tau突变小鼠，该调控关系需在更贴合tau病理的模型中验证；干扰肽目前仅能经脑内注射起效，能否跨越血脑屏障实现外周给药、如何增强神经元靶向性，均有待后续研究。

供稿：Meredith

校对：Joy

美编：Mia.Y & Vanessa