顶刊精要｜Jacob K. Kresovich教授：循环白细胞亚群的丰度与平衡及其与结直肠癌生存的关系

编译者

首次系统性证明治疗前外周循环免疫细胞亚群的丰度和比例与结直肠癌复发及生存密切相关，并通过甲基化细胞术提供可从存档样本获取的高分辨率免疫表型，为术前预后预测提供新工具。

结直肠癌是美国癌症死亡的主要原因之一。既往关于肿瘤免疫的研究主要集中于肿瘤浸润白细胞，包括B细胞和T细胞亚群。由肿瘤组织内CD3⁺总T细胞和CD8⁺细胞毒性T细胞密度构成的“免疫评分”，已在多项队列研究中被证实可用于结肠癌预后评估。然而，肿瘤微环境仅代表抗肿瘤免疫的一部分。多数肿瘤浸润白细胞来源于外周循环，并在淋巴结及三级淋巴结构中被激活、扩增和调控，因此，外周血免疫细胞特征可能反映机体整体免疫能力，并为患者预后提供补充信息。外周免疫细胞还可在肿瘤切除及其他治疗开始前获得，因而具有术前预后评估价值。

传统免疫细胞分析通常依赖新鲜血液样本和流式细胞术，不利于在长期随访队列中应用。DNA甲基化去卷积技术又称“甲基化细胞术”，可利用不同细胞类型特异性的DNA甲基化模式，从保存的血液或DNA样本中间接推算多种循环白细胞亚群的比例。将估算出的细胞比例与外周血白细胞总数相乘，还可获得相应细胞亚群的绝对计数。

研究队列纳入年龄不低于18岁、新诊断为原发性浸润性结直肠癌且既往无浸润性癌症病史的患者。本研究仅纳入在莫菲特癌症中心接受诊疗、诊断为Ⅰ～Ⅲ期结直肠癌，并在手术、化疗或放疗前留存血液样本的患者。研究采用嵌套病例对照设计（嵌套病例对照设计，就是从一个已随访的队列中，选出所有或部分发生结局者，再抽取一部分未发生结局者进行昂贵或深入的生物标志物检测），按照年龄、诊断年份、性别、种族、体质指数、肿瘤分期及原发部位，以约1∶2的比例匹配复发病例与对照。因2例患者缺少白细胞总数，最终纳入134例。

研究收集患者诊断时的年龄、性别、种族、体质指数、肿瘤分期、微卫星状态及肿瘤部位等资料。复发和生存状态随访至2024年9月。全血或白膜层中的基因组DNA经亚硫酸氢盐转化后，使用Illumina Infinium MethylationEPIC v2芯片进行全基因组DNA甲基化检测，并采用ENmix流程完成背景校正、染料偏倚校正、芯片间标准化和探针类型偏倚校正。所有样本均通过质量控制。

研究利用EPIC IDOL-Ext参考库估算12种循环白细胞亚群，包括中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、初始和记忆B细胞、CD4⁺和CD8⁺T细胞、调节性T细胞以及自然杀伤细胞。研究还将相关亚群合并为粒细胞、总B细胞、总CD8⁺T细胞和总CD4⁺T细胞。细胞比例用于表示外周免疫系统平衡，细胞比例乘以白细胞总数后得到绝对计数，用于表示细胞丰度。此外还计算了中性粒细胞与淋巴细胞比值、初始细胞与总B细胞或总T细胞比值、CD8⁺与CD4⁺T细胞比值，以及调节性T细胞与总CD4⁺T细胞比值。

研究采用逆概率加权Cox回归模型分析循环白细胞指标与无病生存和总生存之间的关系。无病生存事件包括疾病复发、新发原发性结直肠癌或死亡，总生存事件为任何原因死亡。基础模型校正诊断年龄和DNA样本来源，完全模型进一步校正性别、种族、体质指数、肿瘤分期、微卫星状态及肿瘤部位。

中位随访时间为7.4年，范围为0.3～13.8年。134例患者中，45例死亡，占34%；33例发生疾病复发，占25%。45例死亡患者中，23例曾发生复发。患者诊断时平均年龄为63岁，女性占46%，男性占54%；直肠癌占54%，结肠癌占46%；93%的患者为白人，78%的患者体质指数超过25 kg/m²。与未复发患者相比，复发患者更可能为非白人，并更常见微卫星稳定型肿瘤。

粒细胞是外周循环中丰度最高的白细胞亚群，平均计数为5.43 K/μL，其后依次为CD4⁺T细胞、单核细胞、CD8⁺T细胞、自然杀伤细胞和B细胞。嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、调节性T细胞、初始CD8⁺T细胞和初始CD4⁺T细胞的丰度最低。年龄与初始CD8⁺T细胞和初始CD4⁺T细胞计数呈负相关，与嗜碱性粒细胞、单核细胞、记忆CD8⁺T细胞及记忆B细胞计数呈正相关。

在仅校正年龄和DNA来源的模型中，循环粒细胞计数升高与较差的无病生存显著相关，每增加1个标准差，疾病事件风险增加34%。这一关系主要由中性粒细胞驱动。完全校正临床因素后，中性粒细胞计数仍与较差的无病生存相关，风险比为1.32。调节性T细胞计数升高同样与较差的无病生存相关，风险比为1.32。B细胞总计数升高与疾病事件风险增加有关，其中记忆B细胞的关联最明显，风险比为1.56，而初始B细胞未显示明显关联。将分析限定于治疗前采血后3年内发生的事件时，记忆B细胞与无病生存的关联仍然存在，风险比为1.63。

与绝对计数相比，白细胞比例与无病生存的关联较少。单核细胞比例升高在基础模型中与较好的无病生存相关，但在进一步校正临床因素后不再具有统计学意义。记忆B细胞比例升高仍与较差的无病生存相关。分层分析显示，记忆B细胞计数与无病生存的关系在直肠癌患者中更强，直肠癌患者的风险比为3.21，结肠癌患者为1.71。

在总生存分析中，粒细胞计数升高与死亡风险增加相关，基础模型中的风险比为1.47。进一步分析显示，中性粒细胞和嗜碱性粒细胞计数升高均与较差的总生存相关。完全校正后，中性粒细胞计数每增加1个标准差，死亡风险增加39%；嗜碱性粒细胞计数每增加1个标准差，死亡风险增加44%。调节性T细胞计数升高也与较差的总生存相关，风险比为1.38。白细胞比例指标中，嗜碱性粒细胞比例升高与较差的总生存相关，完全校正后的风险比为1.47。

分层结果显示，嗜碱性粒细胞计数与死亡风险的关系在直肠癌患者中更明显，风险比为1.75，而在结肠癌患者中未观察到明显关联。该关联在Ⅰ～Ⅱ期患者中也更突出，风险比为1.85，而在Ⅲ期患者中未达到统计学显著性。由于各亚组样本量较小，这些分层结果属于探索性发现。

结论认为，治疗前外周循环白细胞亚群的丰度和相对平衡与结直肠癌患者的生存结局相关。较高的中性粒细胞和调节性T细胞计数与较差的无病生存和总生存相关，记忆B细胞计数升高主要与较差的无病生存相关，而嗜碱性粒细胞计数及比例升高主要与较差的总生存相关。外周免疫细胞组成可识别复发和死亡风险较高的结直肠癌患者，并从系统性免疫状态角度补充肿瘤微环境相关预后信息。