中国发表 | 铁蛋白纳米笼搭载多奈哌齐穿越血脑屏障：EphB1受体介导脑靶向递送新策略

浙江中医药大学陈健尔教授与浙江树人学院徐晓玲副教授团队共同发表临床前研究论文，证实脱铁铁蛋白（AFn）纳米笼特异性结合血脑屏障（BBB）EphB1受体，介导其短暂及可逆性开放，将多奈哌齐脑内蓄积浓度提升3.05倍，显著改善APP/PS1小鼠模型的认知功能并减轻阿尔茨海默病的核心病理特征。

阿尔茨海默病全球患者约为5000万，预计2050年将超过1.5亿。多奈哌齐作为最常用的乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制剂，兼具抗Aβ聚集、抗炎及抗氧化等多重神经保护作用，但其临床疗效受限于BBB穿透率极低——需高剂量给药才能达到脑内最低有效浓度，导致恶心、胃肠不适等不良反应频发。

铁蛋白（ferritin）作为天然蛋白质纳米笼，具有优异的生物相容性，但其跨越BBB的受体机制长期存在争议：早期认为经转铁蛋白受体1（TfR1）介导，但后续研究证实马脾铁蛋白对小鼠TfR1 无结合亲和力，提示存在替代受体。

● 研究设计：体外+体内临床前研究。

● 模型：6月龄雄性APP/PS1转基因AD小鼠及野生型（WT）对照；bEnd.3脑微血管内皮细胞/SH-SY5Y神经元共培养体系。

● 干预：从马脾铁蛋白中去铁制备AFn纳米笼，通过pH介导的解聚-重组法装载DPZ（AFn:DPZ = 5:1），尾静脉注射，隔日一次，持续2周。

● 分组：WT组、APP/PS1模型组、APP/PS1+游离DPZ组、APP/PS1+AFn空载组、APP/PS1+AFn-DPZ组。行为学实验每组 n=4，组织学/ELISA每组 n=3，生物相容性评估每组 n=6。

EphB1是AFn穿越BBB的特异性受体

● 研究团队采用Octet生物层干涉技术进行分子钓饵实验，结合质谱分析，从脑微血管内皮细胞（bEnd.3）膜蛋白中鉴定出EphB1——Eph受体酪氨酸激酶家族成员——为AFn的特异性结合伴侣。分子对接结果显示，AFn与EphB1的最佳对接模型得分为−276.43，置信度评分0.9261，提示二者具有高亲和力结合。

● EphB1是bEnd.3细胞表面的跨膜信号受体，已知通过激活RhoA通路调控内皮细胞骨架重排和紧密连接完整性。本研究通过鬼笔环肽染色和Occludin免疫荧光观察到：AFn加入已形成紧密连接的bEnd.3细胞1小时后，肌动蛋白骨架发生重排，细胞出现收缩，紧密连接蛋白Occludin表达减少，细胞间隙增宽，跨内皮电阻（TEER）值下降；3小时后，紧密连接完整性自行恢复，TEER值回升。这一可逆性的BBB"短暂开放"窗口，为AFn及其载药高效进入脑组织提供了结构基础。

● 使用EphB1抑制剂进行竞争实验进一步验证了该通路的必要性：抑制EphB1后，AFn跨越体外BBB模型的转运效率显著降低。这一结果从因果关系上确认了EphB1在AFn脑靶向递送中的关键作用。

AFn-DPZ纳米制剂的构建与表征

研究通过pH介导的解组装-重组装策略，将DPZ封装于AFn内腔。AFn与DPZ混合后酸化至pH 2.0使蛋白解离为亚基，再调回pH 7.0–7.4促使蛋白重新组装，同步完成药物包封。表征数据显示：

● AFn粒径9.66 ± 0.68 nm，AFn-DPZ粒径11.23 ± 1.78 nm。

● 包封率33.30% ± 1.08%，载药量14.27% ± 0.40%。

● 游离DPZ在12小时内累计释放超过80%，而AFn-DPZ需96小时才达到同等释放水平，体现出显著的缓释特性。

● 4°C储存15天，粒径和Zeta电位变化极小，胶体稳定性良好。

● 各组溶血率均低于5%，血液相容性合格。

脑靶向递送效率的体内验证

● 在APP/PS1转基因AD小鼠模型中，经尾静脉注射AFn-DIR（近红外荧光标记）后1小时即可在脑内观察到强荧光信号，且在1、3、9小时各时间点均显著高于游离DIR组。脑切片共聚焦成像进一步证实AFn-DIR组荧光强度远超游离DIR组（P < 0.001）。

● LC-MS/MS定量分析脑组织中DPZ浓度，以游离DPZ组为参照，AFn-DPZ组在给药后0.25、2、3、24小时的脑内药物浓度倍数分别为3.05 ± 0.21、2.22 ± 0.13、1.54 ± 0.20和1.37 ± 0.13倍。两组血浆DPZ浓度无统计学差异，表明游离DPZ未能有效进入脑组织而滞留于外周循环，AFn载体则显著优化了DPZ的体内药代动力学行为，提升了脑靶向性和脑内生物利用度。

● 体外BBB模型（bEnd.3/SH-SY5Y共培养Transwell体系）同样证实AFn-FITC可跨越内皮单层并被下层神经元以时间依赖方式摄取。

体外神经保护效应

● 在Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞AD模型中，AFn与AFn-DPZ各浓度组细胞存活率均高于95%。Aβ25-35处理导致线粒体膜电位（MMP）显著降低、活性氧（ROS）大量生成。AFn-DPZ处理后，MMP红/绿荧光比值较模型组显著回升（P < 0.05），ROS水平降至最低，提示AFn与DPZ在抗氧化方面具有协同效应。

AD小鼠模型中的治疗效果

● 行为学评估方面，Morris水迷宫实验中AFn-DPZ组小鼠游泳路径最短、逃避潜伏期最低、目标象限停留时间最长、平台穿越次数最高，各项指标均显著优于APP/PS1模型组及游离DPZ组（P < 0.05 ~ P < 0.01）。筑巢实验中，AFn-DPZ组小鼠在第3天即可构建形态完好的巢穴，筑巢评分显著改善。

● 脑组织病理学检测显示，AFn-DPZ组海马和皮质的刚果红染色阳性面积及Aβ免疫组化信号均显著减少，尼氏染色中固缩坏死神经元数量明显降低。ELISA定量结果进一步支持多靶点疗效：海马AChE水平显著下降，Aβ1-42含量大幅降低，促炎因子IL-1β和TNF-α回落至接近正常水平，脑源性神经营养因子（BDNF）表达显著上调。

蛋白质组学揭示的分子网络变化

● 海马组织蛋白质组学分析显示，AFn-DPZ治疗组较APP/PS1对照组存在288个差异表达蛋白（216个上调、72个下调）。GO富集分析显示主要集中于"负调控内肽酶活性"和"丝氨酸型内肽酶抑制剂活性"，与AD患者血清糖蛋白功能谱高度吻合。KEGG通路分析指向"补体与凝血级联"通路——该通路在慢性脑低灌注伴BBB功能障碍的AD病理中被已知激活，加速Aβ清除障碍和病程进展。此外，K19（I型角蛋白中间丝）、IgM重链和A2M-like 1等差异蛋白可能分别参与了EphB1-RhoA信号轴介导的骨架调控、大分子跨屏障转运增强和蛋白酶级联损伤防护。

体内生物相容性

● AFn-DPZ组小鼠心、肝、脾、肺、肾H&E染色未见炎性或损伤性改变；血常规及肝肾功能指标与野生型组无显著差异，证实静脉给药后未引发全身毒性反应。

● 本研究首次明确EphB1为AFn跨越BBB的特异性受体，解决了铁蛋白脑转运机制的长期争议，为开发基于EphB1的脑靶向纳米递送策略奠定了分子基础。

● AFn-DPZ具有以下转化优势：（1）源自天然内源蛋白，生物相容性优异，无体内蓄积风险；（2）无需额外化学修饰即可实现脑靶向；（3）缓释特性可能延长给药间隔；（4）"递送+治疗"双重功能——在提高脑内药物浓度的同时，实现抗Aβ沉积、抗炎、抗氧化及BDNF上调的多靶点协同。

● 本研究策略不仅适用于阿尔茨海默病，还可能拓展至胶质瘤、帕金森病及创伤性脑损伤等涉及BBB功能障碍或EphB1上调的中枢神经系统疾病。

● 局限性：未设物理混合物对照组（因制剂不稳定）；样本量偏小（n=4）；未使用EphB1条件性敲除小鼠进行遗传学验证；AFn载体自身生物活性与药物效应尚未完全解耦；尚未建立GMP级规模化生产工艺。未来需开展更大规模、多中心临床前研究及长期重复给药安全性评价。

供稿：Jaya

校对：Meredith

排版：Jaya / Vanessa