微卫星稳定型结直肠癌靶向治疗后获得性高肿瘤突变负荷与免疫治疗疗效

本文研究的是：微卫星稳定型（MSS）结直肠癌在接受靶向治疗后，是否会因为获得性肿瘤突变负荷（TMB）升高而变得对免疫检查点阻断（ICB）敏感。作者指出，错配修复缺陷/微卫星高度不稳定（MMRd/MSI-H）结直肠癌通常因突变多、 neoantigen 丰富而对ICB敏感；但绝大多数转移性结直肠癌属于MMRp/MSS亚型，通常染色体不稳定而TMB较低，肿瘤浸润淋巴细胞少，对ICB反应差。近年来，EGFR、BRAFV600E、KRASG12C及HER2等靶向治疗虽扩展了部分患者的治疗选择，但在结直肠癌中往往缓解持续时间短、易快速获得耐药。既往研究提示，结直肠癌在靶向治疗压力下可能诱导增强突变的程序，因此作者提出一个问题：这种治疗相关的基因改变增多，能否把MSS结直肠癌“转化”为高TMB肿瘤，从而为后续ICB创造条件。

研究纳入的是在Memorial Sloan Kettering Cancer Center接受基因组匹配靶向治疗的转移性结直肠癌患者，这些患者在基线和进展时有肿瘤组织和/或血浆样本，并通过足以评估TMB的测序平台完成检测。共纳入26例患者，中位年龄51.3岁，54%为男性。组织样本采用MSK-IMPACT检测，血浆游离DNA采用GuardantOMNI检测。研究还进行了突变特征分析、MHC-I结合预测、免疫浸润评估，以及部分病例的单细胞DNA测序。

作者首先评估靶向治疗后肿瘤是否会转变为高TMB表型。26例患者中，治疗靶点包括EGFR 8例、KRASG12C 11例和BRAFV600E 7例。同一时间点血浆TMB通常高于组织TMB，可能因为血浆可汇集多个病灶释放的DNA。为此，研究采用较保守的“获得性高TMB”定义：如果基线和进展样本类型不同，则TMB需增加至少5倍；若前后样本类型相同，则需增加至少2倍；同时进展时还需满足组织TMB＞10 mut/Mb或血浆TMB＞20 mut/Mb。按此标准，26例中有9例在靶向治疗后出现获得性高TMB。

随后，作者分析哪些因素与这种获得性高TMB有关。结果显示，基线时会不会发生后续高TMB，并不能由基线组织TMB、MSI评分或变异类型分布明显区分。与获得性高TMB相关的基线突变特征主要是APOBEC相关特征SBS2以及紫外线暴露相关特征SBS7a/c/d和SBS38，但作者也强调，这部分分析受样本量小和基线单部位活检突变数较少的限制。

关键临床问题是：这些获得性高TMB肿瘤在后续接受免疫治疗时是否真正受益。9例获得性高TMB患者中，仅3例后来接受了ICB，但均无客观疗效。第21号患者为RAS/BRAF野生型直肠癌，累及肝、肺和骨，接受伊立替康联合帕尼单抗后进展。基线肝转移灶组织TMB为6.9 mut/Mb，进展时骨转移灶组织TMB升至11.5 mut/Mb，血浆TMB为40.19 mut/Mb。虽然进展期血浆样本被判为MSI-H，可能与获得性MLH1致病突变有关，但骨转移灶本身仍为MSS/MMRp。患者随后接受帕博利珠单抗，仅1个月即出现明显临床和影像学进展。第25号患者为KRASG12C突变型转移性结直肠癌，接受索托拉西布联合帕尼单抗后，进展时血浆TMB达145 mut/Mb，随后在瑞戈非尼基础上加用帕博利珠单抗，1.4个月后临床和影像学进展。第26号患者为RAS/BRAF野生型直肠癌，基线直肠活检组织TMB 4.9 mut/Mb，血浆TMB 6.7 mut/Mb，进展肝转移灶组织TMB 11.5 mut/Mb；随后入组PD-1抗体联合双特异性抗体临床试验，1.5个月后明显进展，且ICB失败后血浆TMB仍高达124 mut/Mb。

作者进一步评估高TMB是否伴随免疫微环境改变。在第14、21和26号患者的前后配对肿瘤活检中，肿瘤内免疫细胞浸润始终极少或几乎没有，靶向治疗前后均未见明显肿瘤浸润淋巴细胞增加；同时，所有样本均未检测到PD-L1表达。这提示即便TMB升高，肿瘤也并未转化为典型“热肿瘤”状态。

为理解为何高TMB未能转化为免疫治疗敏感，作者详细分析了进展时新出现的基因改变。9例获得性高TMB患者的进展期血浆样本共检测到664个获得性改变，其中61%为单核苷酸变异（SNV），5%为插入缺失，33%为拷贝数变异。TMB的增加主要由SNV增加驱动，而不是插入缺失。约21%的获得性改变位于RTK/RAS/RAF/MAPK通路。突变特征分析显示，进展时最主要的新出现特征是SBS17a/b，这一特征与活性氧（ROS）导致的DNA损伤相关，并且在获得性高TMB病例中比未获得高TMB者更常见。

免疫原性分析进一步解释了这一现象。作者原本推测，由于进展期以错义SNV为主，这些新变异可能不易产生能被MHC-I有效呈递的新抗原。基于有HLA-I分型数据的7例病例，用netMHCpan 4.1预测后发现，虽然进展期确实产生了更多潜在结合肽，但这些由获得性变异产生的肽段，其平均MHC-I结合能力并未明显优于基线突变产生的肽段。也就是说，突变虽然变多了，但免疫学“质量”并没有显著提升。

更重要的是，这些新增突变几乎全部是亚克隆性的。作者发现，9例病例合并分析后，98%的获得性变异属于亚克隆事件，其中98%又是超亚克隆事件。进一步把总血浆TMB分解为克隆性、亚克隆性和超亚克隆性成分后可见：从基线到进展，升高最明显的是总pTMB以及其中的亚克隆/超亚克隆成分，而克隆性pTMB并无统计学显著增加。这提示高TMB主要是由大量低丰度、分散存在的耐药亚群所造成，而不是整个肿瘤主体都统一地积累了高突变负荷。

作者据此提出，血浆检测看到的高TMB，很可能是多个不同病灶、多个不同亚克隆“拼起来”的结果，而并不代表每一个独立病灶都真正是高TMB。在进展期组织样本中，作者实际上只看到极少数推定耐药改变。为验证这一点，他们对第14号患者做了单细胞DNA测序。该患者为KRASG12C突变型结直肠癌，接受adagrasib联合西妥昔单抗后进展，血浆中可见KRAS扩增及多种继发KRAS/NRAS突变，pTMB为62.2 mut/Mb；但对应进展肝活检组织并未检出这些血浆中的继发KRAS/NRAS突变，组织TMB仅8.2 mut/Mb。单细胞测序显示，同一病灶不同区域内，耐药机制也存在明显空间异质性：一个克隆表现为野生型KRAS等位基因扩增，从而相对降低KRASG12C剂量；另一个克隆则表现为KRASG12C剂量相对升高。作者据此认为，靶向治疗后的耐药过程并不是形成一个统一的高突变肿瘤，而是形成许多分散的“耐药小岛”，每个亚克隆本身TMB仍低，但汇总到血浆后就呈现出很高的pTMB。

作者总结说，这项研究聚焦于一类特殊MSS结直肠癌：它们在靶向治疗后，尤其在血浆中可检测到显著升高的TMB，但这种变化并未转化为ICB敏感性。机制上，获得性高TMB主要由大量SNV构成，这类突变通常不如移码indel那样更具免疫原性；同时这些变异几乎全部为亚克隆或超亚克隆事件。作者引用既往研究指出，高克隆性新抗原负荷和低新抗原异质性才更有利于诱导T细胞反应和ICB应答，而高度异质性的肿瘤会稀释新抗原剂量，降低T细胞识别和激活。

关于这些获得性突变是如何产生的，作者结合既往文献认为，靶向治疗压力可能导致DNA错配修复和同源重组相关基因下调，同时诱导DNA损伤、ROS增加，并促使细胞转向更易出错的修复方式，从而形成“适应性可突变性”。在本研究中，SBS17a/b正是最突出的进展期特征，支持ROS相关DNA损伤参与耐药形成。另有1例患者在进展时血浆由MSS转为MSI-H，并出现获得性MLH1致病突变，也进一步支持治疗压力下的适应性突变过程。作者还提出，APOBEC可能是基线时预测后续高TMB和更快获得耐药的潜在线索。

作者还将自己的观察与ARETHUSA研究相联系。后者尝试用替莫唑胺这类诱变化疗先“诱导”MSS结直肠癌产生高TMB，再给予帕博利珠单抗。但与本研究类似，替莫唑胺后升高的TMB也主要由SNV和亚克隆改变构成，克隆性TMB仍低，不同病灶间差异很大，且初步结果未见客观缓解。

最后，作者指出本研究的局限性包括样本量小、仅3例真正接受ICB、患者治疗方案存在异质性、不同时间点采用的TMB检测平台不完全一致，以及转移部位和宿主免疫状态等其他因素也可能影响ICB敏感性。尤其值得注意的是，所有获得性高TMB患者均有肝转移，而肝转移本身就可能削弱ICB疗效。尽管如此，作者的总体结论非常明确：对于靶向治疗后获得性高TMB的MSS结直肠癌，现有数据不支持仅依据这一变化而给予ICB。血浆高TMB并不等于所有病灶都真正转变为高TMB“热肿瘤”；它更像是来自多个病灶、多个低丰度耐药亚克隆的总和，而单个亚克隆的TMB仍不足以触发强有力的抗肿瘤免疫反应。