RET异常实体瘤对选择性RET抑制剂耐药的基因组机制图谱：RETgistry全球联盟分析

RET改变已被证实是多种肿瘤类型中的致癌驱动因素，包括非小细胞肺癌、甲状腺癌及其他实体恶性肿瘤。RET重排见于1%–2%的非小细胞肺癌以及5%–20%的乳头状甲状腺癌。此外，位于激酶结构域或富半胱氨酸结构域的RET体细胞或胚系突变，大约存在于65%的髓样甲状腺癌中。这些致癌改变可导致MAPK、PI3K和JAK-STAT通路发生非配体依赖性激活，从而驱动肿瘤增殖。

晚期RET改变肿瘤患者的治疗格局近年来已发生演变。早期的治疗策略主要是重新利用具有RET抑制活性的多靶点激酶抑制剂，如卡博替尼、仑伐替尼、凡德他尼等。然而，这类药物受到毒性显著、缓解率较低的限制。随着精准医学理念推动了多种驱动基因阳性非小细胞肺癌及其他肿瘤中高效、选择性强并具有中枢神经系统穿透性的靶向药物开发，赛普替尼和普拉塞替尼作为选择性RET抑制剂，改变了这一领域的治疗局面。两项注册性Ⅰ/Ⅱ期研究LIBRETTO-001和ARROW分别推动了赛普替尼和普拉塞替尼获FDA批准，用于治疗晚期或转移性RET重排非小细胞肺癌以及放射性碘难治性RET重排甲状腺癌；此外，赛普替尼还获批用于RET突变型髓样甲状腺癌及RET重排的晚期实体瘤。对于初治晚期RET重排非小细胞肺癌患者，赛普替尼和普拉塞替尼的客观缓解率分别为83%和72%，中位无进展生存期分别为22.0个月和13.0个月。对于既往治疗过的晚期RET重排甲状腺癌患者，两药的客观缓解率分别为79%和91%。

尽管初始疗效显著，患者最终几乎都会对赛普替尼和普拉塞替尼产生耐药。在选择性RET抑制剂治疗后进展时，后续治疗选择十分有限，目前尚无获批的后线靶向药物。此前仅有少数小队列研究探索了选择性RET抑制剂的耐药机制，并报道了部分RET靶点内耐药突变。曾有一项研究分析18例接受赛普替尼和/或普拉塞替尼治疗的RET融合阳性非小细胞肺癌患者的23份进展后活检标本，在其中2例中发现获得性RET突变。MET和NTRK的旁路改变也仅在少量队列或个案中被报道。对于既往是否接受过多靶点激酶抑制剂会否影响耐药机制，目前仍缺乏认识。若能在更大规模队列中全面厘清靶点内与靶点外耐药机制的频率及分布，将有助于指导克服耐药的新药开发。因此，研究者建立了“RETgistry”这一全球协作队列，纳入接受选择性RET抑制剂治疗后发生进展并接受进展后活检的RET改变实体瘤患者，以描绘其基因组耐药机制图谱。

研究对象来自20家参与机构，构成一个全球多中心队列。入组标准包括：经组织学或细胞学证实的晚期或转移性肺癌、甲状腺癌或其他实体瘤；初诊时经局部检测证实存在致癌性RET融合或突变；经当地研究者评估，使用普拉塞替尼和/或赛普替尼后疾病进展；以及进展后接受了组织或血浆活检并行二代测序。既往在选择性RET抑制剂之前接受化疗、免疫治疗或针对RET的多靶点激酶抑制剂均允许纳入。若在使用选择性RET抑制剂前的样本中已经存在其他可靶向基因改变，如EGFR突变、KRAS G12C、BRAF V600E、MET 14号外显子跳跃，或ALK、ROS1、NTRK1-3融合，则予以排除。数据截止日期为2023年8月1日。

各中心通过病历回顾提取患者的人口学、临床和病理学特征，包括肿瘤类型与组织学、基线RET改变、RET融合检测方法以及晚期/转移性疾病阶段接受的全部治疗，尤其是选择性RET抑制剂之前的多靶点激酶抑制剂使用情况。赛普替尼或普拉塞替尼治疗期间的临床结局，包括无进展生存期和停药时间，由各中心研究者判定。所有在赛普替尼或普拉塞替尼治疗进展时获得的活检样本均纳入分析，记录其类型、从开始用药到进展后活检的时间间隔、基因分型结果及所用平台。进展后肿瘤组织的病理学形态也由各参与中心病理医师复核，以评估是否发生组织学转化。对于既往接受过多靶点激酶抑制剂治疗的患者，还提取了这类药物治疗后、选择性RET抑制剂治疗前的活检资料。所有去标识化数据在各中心伦理批准下收集，并统一存储于麻省总医院布莱根癌症研究所的RETgistry REDCap数据库。

统计分析方面，采用描述性统计总结人口学和临床特征，分类变量以频数表示，连续变量以中位数和范围表示。研究者计算了整个活检队列及各亚组中进展后活检检出继发RET耐药突变的比例，亚组根据肿瘤类型、活检类型以及既往是否接受多靶点激酶抑制剂进行划分，组间差异采用Fisher精确检验。对于具有治疗前后配对活检的患者，则进一步分析获得性基因改变。若某基因在治疗前测序中已被覆盖但未检出，而在进展后样本中检出，则定义为“获得性”改变。在配对组织活检中，采用McNemar检验评估治疗后相较治疗前显著富集的基因改变。无进展生存期和停药时间采用Kaplan-Meier法估计，并在有无RET靶点内突变或特定靶点外改变的患者间用log-rank检验比较。

RETgistry共纳入109例晚期或转移性RET改变肿瘤患者，在接受赛普替尼或普拉塞替尼后共获得143份进展后活检标本，其中组织91份、血浆52份。该队列包括94例肺癌患者，共121份活检标本，其中93例为非小细胞肺癌，1例为混合性小细胞/大细胞神经内分泌癌；另有15例甲状腺癌患者，共22份活检标本，包括12例髓样癌、2例乳头状癌和1例未分化癌。

在肺癌队列中，中位年龄61岁，57.4%为女性，72.3%无吸烟史。最常见的RET融合伴侣为KIF5B和CCDC6。121份肺癌进展后活检中，104份来自赛普替尼治疗后，17份来自普拉塞替尼治疗后；另有3例患者先后接受两种药物并均有进展后活检。大多数患者将赛普替尼或普拉塞替尼作为其第一种靶向治疗，余者此前接受过至少一种多靶点激酶抑制剂。29.4%的患者将选择性RET抑制剂作为一线全身抗肿瘤治疗。在甲状腺癌队列中，中位年龄51岁，46.7%为女性。最常见的RET致癌改变为M918T，均见于髓样甲状腺癌患者。3例患者为RET融合阳性甲状腺癌，其融合伴侣分别为CCDC6、ERC1和NCOA4，其余5例均为髓样甲状腺癌，在RET富半胱氨酸结构域或其邻近区域存在突变。22份甲状腺癌进展后活检中，16份来自赛普替尼治疗后，6份来自普拉塞替尼治疗后，大多数患者既往使用过至少一种多靶点激酶抑制剂。

全队列首次使用选择性RET抑制剂的中位随访治疗时间为65.3个月。中位无进展生存期为13.9个月，中位停药时间为17.3个月。在肺癌亚组中，中位无进展生存期为13.0个月，中位停药时间为15.7个月。

在全队列143份选择性RET抑制剂治疗后进展活检中，20份即14.0%检出RET靶点内耐药突变。在121份肺癌进展后活检中，15份即12.4%存在继发RET耐药突变，其中13份为单个RET突变，2份为多个RET突变共存。在这些存在继发RET突变的肺癌标本中，融合伴侣包括KIF5B、CCDC6和EML4。单一继发RET耐药突变主要包括G810位点的溶剂前沿错义突变、V804M门位点突变，以及同时影响V804和G810的插入缺失突变。共存突变则包括G810S与V804M共存，或多个涉及G810的溶剂前沿突变。22份甲状腺癌进展后活检中，5份即22.7%存在继发RET耐药突变，且均来自髓样甲状腺癌患者，包括G810X、A764G，以及G810S、V804M和L881V共存。组织与血浆检测检出RET继发突变的频率相近，分别为12.1%和17.3%，差异无统计学意义。既往是否接受多靶点激酶抑制剂也不影响继发RET突变的检出比例。

此外，在3份进展后组织活检中检测到RET拷贝数增加，约占2.1%，其中2份来自非小细胞肺癌，1份来自甲状腺癌，均发生于赛普替尼治疗后，且与继发RET突变互斥。

在109例患者中，有79例患者具备99对治疗前后配对组织或液体活检，可直接评估治疗过程中获得性基因改变。分析显示，72.7%的进展后样本存在获得性基因改变，其中2.0%仅有RET靶点内突变，10.1%同时存在RET靶点内突变和靶点外改变，60.6%仅存在靶点外改变。也就是说，绝大多数耐药事件并非由RET本身改变驱动，而是与非RET基因改变相关。仅有27.3%的进展后样本未检测到获得性基因异常。

最常见的获得性共改变基因为MET，占18.2%，其中扩增占15.2%；其后为TP53 8.1%、APC 7.1%、KRAS 7.1%、CDKN2A/B 5.1%、KEAP1 3.0%。获得性KRAS突变中既包括具有明确或可能致癌意义的功能获得性错义突变，如G12V、Q61H和V14I，也包括意义未明的M111V。其他获得性改变还包括ERBB2、PIK3CA、EGFR和BRAF的扩增或突变，以及ALK和ROS1融合。在60份仅有靶点外改变而无继发RET突变的活检中，19份携带已有商业化靶向药可针对的改变，如MET扩增、ALK融合、ROS1融合或BRAF V600E；另有10份携带目前尚以研究性药物为主的异常，如非G12C型KRAS改变、EGFR扩增、HRAS Q61L、SMARCA4 M781V和HER2扩增。

考虑到液体活检对拷贝数变化的敏感性低于组织活检，研究者进一步聚焦于68例患者的76对配对组织标本，以比较治疗前后基因改变的差异。结果显示，无论在肺癌与甲状腺癌合并分析还是仅在肺癌亚组中，MET改变在选择性RET抑制剂治疗后均显著富集，而其他反复出现的基因改变则未见显著差异。

关于组织学转化，RET改变实体瘤在选择性RET抑制剂治疗后的真实发生率此前并不清楚。在RETgistry中，75份来自晚期/转移性肺癌患者的进展后组织标本中，仅1份即1.3%表现出从肺腺癌向小细胞肺癌转化的特征。该病例为一名76岁女性，携带KIF5B::RET融合，接受一线赛普替尼治疗后进展；其进展后组织测序还发现TP53、CCND1、FGF3、FGF4和PBRM1的获得性改变。未观察到鳞癌转化病例。在13份接受病理复核的甲状腺癌进展后组织活检中，也未见组织学转化。

研究者还分析了不同分子耐药机制与临床结局的关系。首先按有无继发RET耐药突变比较，整体队列中存在RET耐药突变者的中位无进展生存期为19.7个月，无RET耐药突变者为13.8个月，但差异无统计学意义；两组中位停药时间分别为20.5个月和16.8个月，同样无显著差异。在肺癌亚组中，有无RET靶点内耐药改变也未带来无进展生存期或停药时间的显著差别。

相比之下，MET扩增与更差的治疗持续获益相关。存在MET扩增者的中位无进展生存期为7.8个月，而无MET扩增者为14.8个月，虽未达到统计学显著性，但数值上更短；更重要的是，存在MET扩增者的中位停药时间仅8.4个月，而无MET扩增者为19.0个月，差异具有统计学意义。这提示MET扩增可能是较早出现的耐药驱动因素。

研究者认为，尽管晚期RET改变实体瘤的治疗近年取得了明显进展，但选择性RET抑制剂耐药后的未满足需求仍然显著。对于携带经典EGFR突变或ALK融合的非小细胞肺癌，针对既有靶向治疗耐药机制的认识已被证明对后续治疗策略的开发至关重要。相比之下，选择性RET抑制剂耐药机制的认识迄今仍主要来自单中心或小样本研究，难以形成全面图景。RETgistry纳入143份进展后活检，提供了迄今为止规模最大的国际多中心分析。

本研究显示，RET靶点内耐药突变的比例仅为14.0%，无论既往是否接受过多靶点激酶抑制剂，发生率都较低，这提示RET改变肿瘤中选择性RET抑制剂耐药更常由靶点外机制主导。该比例明显低于EGFR突变或ALK重排非小细胞肺癌在第一代或第二代酪氨酸激酶抑制剂治疗后40%–65%的靶点内耐药比例，但与第三代EGFR或ALK抑制剂一线治疗后较低的靶点内耐药比例相似，可能反映了选择性RET抑制剂具有更优的效力、选择性以及针对门位点突变的前瞻性药物设计。

在靶点内耐药突变中，突变谱较窄，主要集中于G810位点。G810溶剂前沿突变此前已被认为是选择性RET抑制剂耐药的反复出现机制，目前尚无获批药物能够有效抑制RET G810X，因而构成明显未满足需求。研究中还观察到涉及V804位点的门位点突变。虽然前期研究显示选择性RET抑制剂对RET V804突变仍有活性，但V804与G810共存的情况已在赛普替尼耐药标本中报道。值得注意的是，研究还在甲状腺癌患者中发现A764G和L881V等少见继发突变，其中A764G此前尚未被报道为RET抑制剂耐药机制，L881V虽曾在家族性髓样甲状腺癌中作为胚系变异出现，也曾在前临床模型中与凡德他尼耐药相关，但此前并未与选择性RET抑制剂耐药直接关联。这些突变是否真正介导耐药，仍需功能学验证。

相较之下，靶点外改变更具主导性。研究中有60.6%的病例仅检测到非RET基因的获得性改变而无继发RET突变，其中MET扩增是最突出、最反复出现的机制，且与继发RET突变互斥。值得注意的是，MET扩增也是多种基因驱动型非小细胞肺癌在新一代靶向药治疗后常见的耐药机制，在本研究中其发生率为15.2%，与EGFR突变或ALK阳性非小细胞肺癌耐药后的报道接近。前临床研究已证明，MET扩增足以介导RET抑制剂耐药，其机制是绕过原始驱动基因，独立激活MAPK、STAT和PI3K/AKT信号通路。在临床实践中，一旦在进展后活检中发现MET扩增，就可能为联合MET抑制剂与原驱动基因靶向药的治疗策略提供依据。因此，进展后活检对于指导下一线治疗具有关键意义。

此外，MET扩增与较短的停药时间相关，也提示它可能是较早发生的耐药驱动因素。对于在选择性RET抑制剂治疗中较快进展的患者，其肿瘤更可能存在MET介导的耐药。不过，这一发现仍需在更大队列中验证，也需要进一步阐明为何MET扩增会更早出现。

除MET外，研究还发现多个调控MAPK或PI3K信号通路的基因，如KRAS、BRAF、EGFR、ERBB2、ALK、ROS1和PIK3CA，以及肿瘤抑制基因如TP53、APC、KEAP1和CDKN2A/B，在治疗后出现获得性改变。当前尚不清楚这些异常究竟是真正的耐药驱动因素，还是仅仅伴随肿瘤演化的“乘客”事件。不过，在其他驱动基因阳性肿瘤中，上游MAPK/PI3K通路异常早已被证实能够介导靶向治疗耐药，而CDKN2A/B、KEAP1和TP53等基线异常也常与较差疗效相关。因此，这些在RET抑制剂耐药后出现的非RET改变值得进一步研究。另一方面，约27%的队列中未检测到任何获得性基因异常，这也提示未来还必须加强对非基因组耐药机制的探索。

本研究结果提示，克服选择性RET抑制剂靶点外耐药是后续治疗策略开发的重点。目前对于选择性RET抑制剂进展后的非小细胞肺癌，化疗仍是标准下一线方案，但获益有限。既往个案中，赛普替尼联合TRK抑制剂拉罗替尼曾在一例获得性NTRK3融合的RET突变型髓样甲状腺癌患者中实现疾病控制；赛普替尼联合MEK抑制剂曲美替尼也曾在一例获得性BRAF融合的RET融合阳性非小细胞肺癌中显示疗效。类似地，在EGFR突变型非小细胞肺癌中，EGFR抑制剂联合RET抑制剂已经被用于克服获得性RET融合所致的耐药，但反过来，对于RET改变肿瘤中因EGFR异常导致的选择性RET抑制剂耐药，这类联合方案是否同样有效仍不清楚。未来亟需进一步探索合理的联合治疗策略，以拓展治疗选择并改善患者结局。与此同时，也应研究如何延缓或避免耐药发生，例如更深入理解药物耐受残存细胞的生物学，并发展更先进的疾病监测技术，以便在耐药克隆形成前尽早强化治疗、清除残余肿瘤群体。

本研究也存在若干局限性。这是一项回顾性分析，可能存在选择偏倚和转诊偏倚。由于队列覆盖多个国家和中心，组织及血浆样本使用的二代测序平台并不统一，可能影响分析结果。为减轻这一局限，研究者仅在治疗前后检测平台均覆盖相关基因时才将其认定为获得性改变；治疗前后富集分析也仅限于配对组织活检。研究对转移灶数量、治疗中进展模式，以及配对活检是否来自同一病灶等信息掌握有限，因此不同病灶间的肿瘤内异质性可能影响结果。甲状腺癌患者数量较少，也限制了该亚组分析的统计效能。由于队列规模仍有限，本研究无法比较赛普替尼和普拉塞替尼各自的耐药谱。未来仍需针对甲状腺癌及其他非非小细胞肺癌肿瘤进一步定义耐药机制。此外，本研究中选择性RET抑制剂的临床结局与LIBRETTO-001和ARROW等前瞻性注册研究存在偏差，因为本队列是回顾性筛选出已经发生耐药进展的真实世界患者，自然会使无进展生存曲线整体向较短时长偏移。

总之，本研究在接受选择性RET抑制剂后进展的RET改变肿瘤患者活检中，仅有14.0%检测到RET靶点内耐药突变，提示靶点外耐药机制占主导地位。研究识别出广泛的获得性靶点外改变，其中MET扩增不仅是最常见、最重复出现的耐药机制，还可能是较早出现的耐药驱动因素。持续深入解析RET改变肿瘤对选择性RET抑制剂耐药的生物学基础，对于开发克服或延缓耐药的新策略、改善患者预后至关重要。