组合液体活检用于转移性非小细胞肺癌预后评估

非小细胞肺癌约占全部肺癌的 80%–90%。临床治疗决策高度依赖诊断时的组织活检信息，但由于组织获取的局限性，探索更为便捷的检测方法具有重要意义。液体活检能够提供肿瘤信息，其潜在用途包括早期发现、辅助诊断以及监测治疗反应。目前循环肿瘤细胞与 ctDNA 均是研究较多的液体活检成分，而直径小于 200 nm 的小尺寸细胞外囊泡也逐渐受到重视，在多种癌症中被证明与肿瘤特征相关。由于肺癌常因取材困难而无法获得足量组织，在此背景下液体活检更具应用价值。例如，ctDNA 可用于检测 EGFR 靶向突变，而循环肿瘤细胞数量也被多项研究证实与预后密切相关。

此前报道，在非小细胞肺癌患者中检测到循环肿瘤细胞，特别是 PD-L1 阳性的循环肿瘤细胞，与预后较差显著相关，且这一结果与治疗方式及分子亚型无关。由此可见，单一液体活检成分能够提供有价值的生物学与临床信息，而多种成分的组合测定可以进一步提供互补的信息。例如，PD-L1 阳性囊泡在多种癌症中已被研究，其与其他液体活检成分（如 ctDNA）联合可提高 EGFR 突变检测的敏感性。本研究希望在不受治疗方式、肿瘤分型或疾病阶段限制的真实临床人群中，探讨循环肿瘤细胞、PD-L1 阳性囊泡与 ctDNA 三者单独或联合的预后价值，以评估其是否能够提供优于单一标志物的预后信息。

本研究纳入 60 例 III–IV 期非小细胞肺癌患者，最终有 51 例患者同时具备三种液体活检成分的完整资料。血样采集于诊断时、首次治疗前或治疗进展时。循环肿瘤细胞的分析均在研究期间前瞻性完成，而 ctDNA 与囊泡分析则在患者全部入组后进行回顾性检测。在循环肿瘤细胞分析中，使用 CellSearch® 系统对 EpCAM 阳性的细胞进行富集并检测。该系统通过细胞表面标志物、细胞角蛋白及 CD45 的免疫荧光染色以及核酸染色以识别循环肿瘤细胞。此前研究已报道 54 例患者的循环肿瘤细胞检测结果，本研究对其作进一步整合。

在 ctDNA 分析中，54 例患者均成功获得检测结果，其中 20 例（37%）检测到至少一种热点突变。最常见的突变是 EGFR 与 KRAS，分别占 24.1% 与 14.8%。没有检测到 BRAF 或 ERBB2 的热点突变。Kaplan–Meier 生存分析显示，ctDNA 是否存在突变与总体生存之间没有显著相关性，亦与无进展生存无关。当将突变进一步分为 KRAS 与 EGFR 两类时，这些突变的存在仍未显示对总体生存或无进展生存具有显著影响。在肿瘤组织样本中，EGFR 与 KRAS 的突变状态与生存之间的关系略有不同，但总体上组织中存在突变与更长的生存相关。ctDNA 与组织之间的突变一致性为 35%，提示 ctDNA 的确部分来源于肿瘤的 DNA 释放。

在小尺寸细胞外囊泡分析中，53 例患者成功获得囊泡数据。纳米颗粒分析显示囊泡平均粒径约 148 nm，模式粒径约 120 nm，其浓度中位数约 2.46×10^12 个/ml。囊泡标志物如 ALIX、TSG101 等被成功检测到，而 GRP94 的缺失提示无细胞污染。PD-L1 阳性囊泡在大部分患者中均可检测，平均浓度为 16.9 pg/ml。该浓度与总囊泡量、循环肿瘤细胞状态及其他临床特征均无关，但随着诊断到入组时间延长呈下降趋势。生存分析显示，PD-L1 阳性囊泡浓度与总体生存显著相关，而与无进展生存无明显关系。

进一步分析显示，循环肿瘤细胞状态会影响 PD-L1 阳性囊泡浓度对无进展生存的影响。在无循环肿瘤细胞的患者中，高 PD-L1 阳性囊泡浓度显著缩短无进展生存，而在检测到循环肿瘤细胞的患者中则无明显影响。多变量分析进一步确认了这些趋势。

研究通过最大选取秩统计法确定 PD-L1 阳性囊泡的高低界限，将患者按是否存在循环肿瘤细胞、ctDNA 是否突变及 PD-L1 阳性囊泡水平分组，评估不同组合对预后的影响。结果显示，仅存在循环肿瘤细胞或仅存在高 PD-L1 阳性囊泡均显著缩短总体生存；二者共存时风险倍增，预后最差。ctDNA 是否存在突变对风险的影响远弱于上述两者。无进展生存结果亦呈相似趋势。

研究者指出，液体活检技术可用于实时监测肿瘤进展、预后评估及治疗反应预测。循环肿瘤细胞及 PD-L1 阳性囊泡可提供更全面的功能与表型信息，而 ctDNA 更多反映肿瘤细胞死亡后的遗传物质释放，因此三者在生物学上具有互补价值。本研究显示，将循环肿瘤细胞与 PD-L1 阳性囊泡联合检测，可以更准确识别预后不良的高风险患者。

研究也指出了一些限制，包括样本量较小、囊泡分离方法缺乏标准化、CellSearch® 系统可能漏检部分非上皮化循环肿瘤细胞等。未来需要更大规模、多中心的临床试验验证这些结果。

综上所述，循环肿瘤细胞的存在及高水平 PD-L1 阳性囊泡均可作为独立的不良预后标志物，而其联合检测可进一步提升预后预测能力。液体活检多组学组合策略有望推动个体化肺癌管理的进一步发展。