超灵敏ctDNA动态分析在接受免疫治疗的实体瘤中的广泛应用

癌症免疫治疗通过利用患者自身的免疫系统来识别和清除肿瘤细胞，彻底改变了肿瘤治疗格局。自2011年首个免疫检查点抑制剂（ICI）获批治疗转移性黑色素瘤以来，针对CTLA-4、PD-1、PD-L1和LAG-3等关键免疫检查点的抗体药物研发进入了快车道。目前，已有超过10种免疫检查点抑制剂被FDA批准用于40多个不同的癌症适应症，使其成为临床应用最广泛且最具商业价值的肿瘤疗法。此外，双特异性抗体和免疫细胞接合器等新型免疫疗法也在临床试验中展现出令人振奋的前景，极大地丰富了免疫治疗的武器库。尽管取得了巨大进展，但免疫检查点抑制剂在未筛选患者中的总体缓解率仍较低，通常维持在10%至20%之间。虽然研究人员探索了PD-L1表达、肿瘤突变负荷和微卫星不稳定等预测性生物标志物，以精细化患者选择并提高疗效，但PD-L1表达的预测能力在不同肿瘤类型和治疗环境中表现并不一致。由于癌症生物学和免疫环境的内在异质性，开发可靠且广泛适用的免疫治疗反应生物标志物面临巨大挑战。鉴于此，临床迫切需要稳健且普适的生物标志物，以预测多种癌症类型的免疫治疗结果。

免疫治疗的反应模式与传统疗法显著不同，为了捕捉这些特征，研究者提出了免疫疗效评价标准（iRECIST）的修订版。然而，这些标准尚未得到充分验证。基于血液的生物标志物监测有助于确定治疗获益，特别是区分假性进展与真实进展。纵向监测生物标志物在监控具有持久获益的患者、促进早期发现疾病进展以及指导治疗选择方面具有巨大潜力。在此背景下，由肿瘤细胞释放到血流中的ctDNA已成为一种极具前景的非侵入性生物标志物。在转移性患者中的研究表明，ctDNA动态可以预测非小细胞肺癌及多种接受免疫治疗的癌症患者的临床获益。尽管如此，在完全理解ctDNA在该领域的潜力之前，仍有多个局限性需要解决。主要缺陷包括：一是以往仅追踪有限数量的肿瘤突变，可能导致敏感性受限并增加假阴性率；二是未能充分考虑根据iRECIST标准在出现免疫未确认的疾病进展后继续接受免疫治疗的患者；三是缺乏关于标准免疫检查点抑制剂之外的新型免疫疗法的数据。

本研究通过对包含24种肿瘤类型的转移性全癌种队列进行纵向超灵敏ctDNA分析，弥补了现有文献的空白。研究采用了基于肿瘤信息的全基因组测序（WGS）超灵敏ctDNA检测方法，每个血浆时间点可追踪多达1800个肿瘤特异性突变，检测限低至1至3 ppm（百万分之一）。为了评估这种水平的分析价值，分析了来自不同晚期癌症患者的1455份纵向血浆样本，这些患者接受了免疫检查点抑制剂或其他新型免疫治疗方案。研究涵盖了一个由136名患者组成的初步回顾性队列和一个由66名患者组成的独立前瞻性验证队列。研究结果强调了超灵敏ctDNA监测作为预测免疫治疗获益的强大非侵入性工具的潜力，能够区分真实进展与假性进展，并对获得放射学缓解和长期生存的患者进行纵向监测。

所有血浆样本均收集在cfDNA保护管中，并在24小时内通过双重离心处理。肿瘤样本来源于手术或穿刺活检。对于大多数肿瘤样本，从FFPE切片中提取DNA。利用MuTect等工具从肿瘤和配对的正常样本中识别体细胞单核苷酸变异（SNV）。针对每个患者，设计了定制的杂交捕获探针组，用于追踪基因组范围内多达1800个突变。ctDNA水平以PPM表示，通过单尾泊松分布测试确定ctDNA的存在。分子缓解（ctDNA-mR）定义为与基线相比，治疗第二周期前ctDNA降低幅度不少于30%。分子清除（ctDNA-mCR）定义为治疗过程中至少有一个时间点检测不到ctDNA。

结果显示，该超灵敏分析在全癌种队列中具有一致的检测能力。在202名患者中，成功为202名设计了基于肿瘤信息的超灵敏检测方案。每个患者选取的体细胞变异中位数为1830个。分析实现了1.9 PPM的中位检测限，治疗前的基线敏感性达到98.0%。在基线样本中，ctDNA中位水平为38,155 PPM，不同癌症组之间存在显著差异，其中间皮瘤水平最低，非小细胞肺癌最高。基线ctDNA水平低于相应肿瘤亚群中位数的患者，其无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）均有改善。在治疗过程中，ctDNA水平通常低于基线。获得放射学客观缓解（PR或CR）的患者，其在观察期间的最低ctDNA水平显著较低。同样，获得持久临床获益（DCB）的患者，其最低检测到的ctDNA水平也显著较低。相比之下，RECIST评价为疾病进展的患者，其治疗期间的最低ctDNA水平显著高于评价为稳定或缓解的患者。

早期ctDNA动态与临床结果的改善密切相关。通过分析从基线到第二周期前的ctDNA变化，旨在最早时间点识别放射学进展高风险患者。结果表明，达到ctDNA-mR的患者，其PFS和OS均显著延长，且客观缓解率远高于未达到者。相比之下，ctDNA增加的患者中，绝大多数在后续观察中出现了进展，且客观缓解率为零。对于获得CR或PR的患者，100%在早期表现出ctDNA下降。这些发现表明，早期的ctDNA动态，尤其是分子缓解的达成，可以作为识别免疫治疗获益和预后良好的可靠生物标志物。

进一步探索发现，ctDNA清除（mCR）与免疫治疗患者的长期生存高度相关。在初步队列中，达到ctDNA清除的患者，其中位PFS持续时间是不清零者的三倍以上，且69%的患者存活时间超过5年。在多个案例中，ctDNA的清除先于影像学观察到的肿瘤显著缩小。为了验证超灵敏度的必要性，研究者将实际结果与模拟较低敏感度（100 PPM）的结果进行了对比，发现灵敏度降低会导致生存预测的准确性下降，错误地将具有微小残留病灶（MRD）的患者归类为清除。这表明，要准确判定ctDNA清除，超灵敏检测是必不可少的。此外，ctDNA清除在时间上显著早于放射学上的完全缓解（CR），中位领先时间达230天。

在多变量模型中，分子缓解比传统非ctDNA生物标志物具有更高的预测价值。研究者结合了临床病理变量进行评估，发现ctDNA-mR、基线乳酸脱氢酶（LDH）水平和肝转移情况是PFS的显著预测因子。在OS的预测中，ctDNA-mR同样展现了极强的独立预后价值。免疫治疗的模式或靶点并未对风险产生显著影响，这说明ctDNA-mR提供的信息超出了常规临床数据，有助于更精准地进行风险分层。将早期ctDNA数据与临床病理特征联合建模，显著提高了模型的预测准确性。

此外，研究者利用无监督聚类算法对患者的纵向ctDNA模式进行了分析。聚类分析将患者分为两个截然不同的亚组。第一组表现出ctDNA信号随时间普遍下降的趋势，而第二组轨迹相对稳定或上升，且中位ctDNA水平显著更高。这种聚类有效地根据早期治疗反应和生存期对患者进行了分层。第一组患者的5年PFS和OS显著优于第二组。这种基于全局ctDNA模式的分析框架，为评估患者个体化疾病轨迹和治疗历史提供了新视角。

综上所述，本研究强调了超灵敏ctDNA作为跨癌种和免疫治疗模式的通用生物标志物的广泛适用性。通过追踪大量突变并实现极低的检测限，该方法能够捕捉到传统检测可能遗漏的微弱信号。这种非侵入性的监测手段不仅能极早预测疗效，还能为假性进展的鉴别、治疗获益的评估以及长期生存的预测提供有力支持。这些数据支持将ctDNA分析更广泛地应用于癌症免疫治疗的临床管理，优化治疗决策，并最终改善患者预后 。