靶向治疗后获得性高肿瘤突变负荷的微卫星稳定型结直肠癌中对免疫治疗的反应

免疫检查点治疗已经显著改变了MMRd / MSI-H结直肠癌患者的治疗结果，因为此类肿瘤由于MMR基因缺陷导致突变负荷高、肿瘤新抗原丰富，因此对ICB高度敏感。但绝大多数转移性结直肠癌属于MMRp / MSS类型，突变负荷低，肿瘤浸润淋巴细胞少，对ICB几乎无反应。除POLE突变亚群外，MSS结直肠癌仍缺乏有效免疫治疗策略。随着EGFR、BRAF V600E、KRAS G12C、HER2等靶向治疗的发展，基于分子分型的治疗已延长部分MSS患者生存，但CRC对靶向药获得性耐药发生快，靶向治疗获益有限。既往研究提示，在靶向压力下，CRC可能会启动适应性可变突变程序，产生大量耐药突变。本研究提出问题：靶向治疗是否能够人为推高MSS CRC的TMB，使其变成“hypermutated状态”，进而转化为可免疫治疗敏感。

MSK的研究者选取26例接受基因匹配靶向治疗、并在治疗前后均有组织或ctDNA样本进行NGS检测的MSS转移性CRC。患者接受EGFR抑制、KRAS G12C抑制、BRAF V600E抑制等治疗。比较治疗前后TMB变化，定义出现≥5倍TMB升高（不同类型样本时）或≥2倍升高（相同类型样本）且进展时pTMB≥20 mut/Mb或组织TMB≥10 mut/Mb为获得性高TMB。26例中9例在治疗进展时出现获得性高TMB，且pTMB普遍高于tTMB，提示多发病灶总的突变情况可通过cfDNA反映，但单灶组织内并未真正形成一致的高TMB。

三名获得高TMB的患者接受后续ICB，但均快速进展，无临床反应。PD-L1表达无提升，进展组织缺乏TIL浸润。突变分析显示，获得性突变多数为无义SNV，且新突变中以ROS相关的SBS17a/b signature最为典型，说明此类高突变主要来自治疗压力诱导的氧化应激损伤与错误修复。而新抗原分析提示虽然突变数量多，但突变并未显著提高MHC-I结合亲和力结构层面免疫原性。更重要的是，98%的获得性突变为高度亚克隆/超亚克隆水平（VAF远低于主要驱动），意味着这些突变在不同部位独立出现，彼此不成为统一克隆免疫识别靶点。pTMB升高只是多个耐药亚群求和而来，并非每个病灶都真正变成“高突变一致克隆”。

进一步在一位案例进行单细胞DNA测序，证实同一转移灶内部存在不同方向的KRAS G12C耐药机制：部分细胞扩大WT KRAS拷贝，降低突变KRAS剂量；另一部分则提升KRAS G12C剂量，这提示高染色体不稳定导致多分支异质耐药克隆共存。单灶组织中可检测到的耐药突变极少，这也与cfDNA反映出的大量亚克隆突变不一致。本质上，所谓获得性高TMB是来自多灶多克隆同时存在的“耐药岛屿”，且每个岛的真实局部TMB仍低，导致免疫系统不能产生有效清除能力，ICB无法真正识别和清扫。

现有MSS CRC“诱导高TMB→再接ICB”的试验思路，包括以TMZ诱导MMR缺陷的策略（如ARETHUSA），在本研究观察也高度一致：增加的突变质量类型不对、分布不对、克隆不对，因此不产生免疫反应。本研究的真实世界数据证实，在靶向治疗压力下MSS CRC的“高TMB”不是可转换免疫表型，而是耐药复杂化、亚克隆碎片化。如果要让MSS CRC真正变成“hot tumor”，需要在所有病灶层面普遍一致地提高TMB，而不是多灶独立演化。现有靶向诱导突变策略无法实现这一点。

本研究结论明确：MSS CRC在靶向治疗后获得性高TMB不能作为ICB适用依据，血TMB高并不代表真实肿瘤内免疫应答能够启动。未来若要利用突变过程转化免疫冷肿瘤，必须让TMB提升变成克隆性一致、免疫原性可识别而不是亚克隆拼图。