胃食管癌腹膜癌病灶的腹腔内CAR T细胞治疗：从临床前研究到I期临床试验（NCT06623396）

腹膜癌是胃食管腺癌常见的转移方式，约三分之一的患者在出现转移时会伴随这种情况。这类患者对化疗和免疫治疗均高度耐药，中位生存期仅为3到5个月。其免疫微环境具有显著的免疫抑制特征，包括大量M2型巨噬细胞、抑制性细胞因子以及肿瘤浸润淋巴细胞稀少，使得传统免疫疗法反应极差。为了改变这种环境，研究者尝试通过嵌合抗原受体T细胞（CAR T）治疗来提升肿瘤浸润淋巴细胞数量。CAR分子是一类人工受体，能够使T细胞特异识别肿瘤相关抗原。间皮素（mesothelin, MSLN）是胃食管腺癌常见的高表达分子，且与肿瘤侵袭性相关，因此成为重要靶点。既往在胸膜腔局部给药的CAR T研究中已经显示，局部输注相比静脉输注能以较低剂量获得更优疗效，并有助于维持CAR T细胞的功能和数量，甚至在1次注射的100天后仍可在血液循环中被检出。本研究的目的即是构建临床相关的小鼠模型，比较腹腔内与静脉输注的差异，并开发一种新型结构的CAR T。

研究者首先在小鼠中建立了胃食管腺癌的腹膜癌病灶模型。研究使用了KYAE-1和SK-GT-4细胞，均被改造为过表达MSLN并携带GFP-荧光素酶，以便进行活体成像。模型小鼠表现出典型临床特征，包括腹水、肠梗阻，以及腹水中高水平的TGF-β（可达1800–6000 pg/mL），再现了人类疾病的免疫抑制环境。随后研究团队构建了一种新型CAR结构M28z1XXPD1DNR：它由针对MSLN的单链抗体片段与CD28共刺激和CD3ζ信号区连接，其中CD3ζ只保留一个免疫受体酪氨酸激活基序（1XX），以增强持续性；同时引入了PD-1显性负突变受体（DNR），该结构缺乏细胞内抑制信号，只保留胞外结构，起到PD-1“诱饵”作用，减少T细胞衰竭。这样的设计使得CAR T在肿瘤免疫抑制环境中更持久有效。

体外实验表明，这些CAR T细胞在与不同水平MSLN表达的肿瘤细胞共培养时，表现出与抗原强度相关的细胞毒性，能够显著扩增并分泌干扰素γ、IL-2和TNF-α。重复抗原刺激实验也显示其具有良好的增殖和功能保持能力。在标准的铬释放实验中，CAR T能高效杀伤靶细胞，而对照的未转导或针对无关抗原PSMA的CAR T几乎无效。进一步的检测显示，该CAR T能在多次刺激后依旧扩增并保持效应。

在动物实验中，研究者比较了腹腔内与静脉给药的效果。在KYAE1-GM模型中，腹腔内注射1×10^5 CAR T细胞就能显著抑制肿瘤，延长生存，而静脉给药即使剂量高五倍也远逊于前者。类似结果在SK-GT-4模型中得到验证。生存曲线显示，腹腔内给药的小鼠明显获益。更为重要的是，这些CAR T表现出功能持久性：在接受低剂量CAR T治疗后超过84天存活的小鼠再次接受肿瘤复种时，依旧能迅速清除肿瘤信号，提示细胞长期存在并保持功能。这种持久性被认为与PD-1 DNR构造密切相关。

为了模拟患者常见的多部位转移情形，研究又建立了“左右双侧皮下肿瘤+腹膜病灶”复合模型：左侧为MSLN阳性肿瘤，右侧为阴性肿瘤，腹腔内另种植MSLN阳性肿瘤。结果显示，腹腔内给药组不仅快速清除了腹腔病灶，还能在第11天起显著缩小远处左侧阳性瘤体，而静脉给药组直至第17天才出现效果。30天时，腹腔给药小鼠全部存活，而静脉组已有部分因肿瘤负荷过大而安乐死。对比不同处理方式可见，CAR T的活化方式和给药途径决定了其远处效应。体外预活化的CAR T静脉给药会导致肺部毒性，而腹腔内给药则可在原位被抗原再次激活，从而扩增并浸润远端肿瘤。对照的右侧MSLN阴性瘤体几乎没有T细胞浸润，证明该治疗高度依赖抗原特异性。

综合这些结果，研究认为腹腔内给药的CAR T细胞能在免疫抑制的腹膜环境中获得原位激活，随后扩增并迁移至远处病灶，从而兼具局部与全身效应，疗效优于静脉给药。同时，这种方式还能减少全身毒性，因为T细胞的激活更局限于肿瘤部位，而非外周循环。进一步分析显示，腹腔给药的CAR T群体中CD8+细胞比例更高，激活标志物HLA-DR水平更强，而静脉或体外预活化组则不及。

基于上述前临床证据，团队已启动了一项I期临床试验（NCT06623396），针对MSLN阳性的胃食管腺癌腹膜癌病灶。患者首先接受淋巴清除性化疗（环磷酰胺或氟达拉滨），随后在第0天接受单次腹腔内CAR T细胞输注，设定五个剂量水平，采用改良连续重新评估法进行剂量爬坡，预计入组4至18例。患者在门诊随访4周，之后每8周影像学评估，最长可达2年，以观察安全性、耐受性和初步疗效。目前该试验已获FDA及机构审查批准，正在招募。

这项研究在高度相关的小鼠模型中证明了腹腔CAR T治疗的独特优势。与既往脑肿瘤的脑室或肿瘤内输注类似，区域给药可以绕过实体瘤的屏障问题，直接在局部建立强效免疫应答，同时扩展到远处病灶。MSLN作为目标抗原再次被证明是胃食管癌相关腹膜病灶的重要标记。研究所设计的M28z1XXPD1DNR结构，利用1XX信号调控和PD-1 DNR诱饵机制，显著增强了CAR T在免疫抑制环境下的持续性和效能。动物实验所观察到的长效生存和再挑战保护提示临床转化的巨大潜力。文章也指出，未来仍需关注潜在毒性与患者间差异，并可能探索与其他免疫疗法联合策略。

   总之，该研究首次系统展示了腹腔内CAR T治疗胃食管癌腹膜癌病灶的可行性与优越性，提出了一个新的治疗策略。它不仅克服了局部免疫抑制，也能控制远端病灶，为这一预后极差的人群带来新的希望。随着I期临床试验的开展，结果将进一步检验这种治疗模式的安全性和有效性。如果得到验证，腹腔内CAR T有望成为治疗胃食管癌腹膜转移的重要突破。

图1：肿瘤局部与远处部位在腹腔内输入CAR T细胞后的抗肿瘤效应

(A) 肿瘤再挑战实验示意图显示，在CAR T细胞治疗后，初始的BLI信号下降；于第84天进行肿瘤再挑战后，BLI信号一度升高，但至第89天逐渐下降并恢复至基线水平，提示CAR T细胞在体内具有功能性持久存在（n=10个生物学重复）。

(B) 左图：双侧皮下移植模型示意图，腹腔内有KYAE1-GM细胞的肿瘤负荷；左侧皮下移植的KYAE1-M细胞表达MSLN抗原，右侧皮下移植的KYAE1-E细胞不表达该抗原。中图：比较腹腔内（蓝线）或静脉（绿色线）输入CAR T细胞后，左侧肿瘤体积缩小的差异，并与PSMA靶向CAR T细胞治疗对照。右图：同一批小鼠中腹腔肿瘤BLI信号的相应下降情况。所示数据为使用两位独立供者细胞进行的两次技术重复的代表性结果。PSMA组n=5；IP组和IV组n=7。

(C) 左图：实验队列示意图，分别包括：（1a）将体外活化的CAR T细胞经腹腔注入无腹腔肿瘤的双侧移植模型小鼠；（1b）将未活化CAR T细胞经腹腔注入无腹腔肿瘤的双侧移植模型小鼠；（1c）将未活化CAR T细胞经静脉注入无腹腔肿瘤的双侧移植模型小鼠；（2a）将未活化CAR T细胞经腹腔注入带有KYAE1-GM腹腔肿瘤的双侧移植模型小鼠；（2b）将未活化CAR T细胞经静脉注入带有KYAE1-GM腹腔肿瘤的双侧移植模型小鼠。中图：展示来自队列1a与2a小鼠左侧肿瘤负荷下降的动态变化。右图：定量分析了各队列取出的皮下肿瘤中每克组织检测到的CAR T细胞数量。所示数据为使用两位独立供者细胞进行的两次技术重复的代表性结果，每个队列n=7只小鼠。

图2：  I期临床试验设计